GST pull-down实验指南：从实验原理到操作步骤，蛋白互作必掌握

Pull-down有条带就能说明两个蛋白直接互作吗？条带越深蛋白互作越强吗？简简单单的Pull-down实验真的很难吗？

这一期我们就以GST pull-down实验为例，从实验原理到操作步骤一次性把Pull-down讲清楚，让您轻松做出漂亮结果，早日发Paper。

以生物素、GST或His等标签的融合蛋白为诱饵蛋白（Bait），将其进行表达纯化并固定在对应的亲和固相支持物上，然后与目的蛋白或含目的蛋白的细胞裂解液共孵育，捕获能够与诱饵蛋白相互作用的猎物蛋白（Prey），最后通过洗涤、洗脱、WB或质谱检测，完成蛋白质互作分析。

通常能用于蛋白质纯化的标签都可用于Pull-dowm实验，比如GST、His、FLAG、MBP、生物素等。对应的亲和固相支持物也会存在差异，如琼脂糖珠、凝胶、磁珠、纤维素珠等。但不管采用哪种策略设计实验，原理和操作步骤基本类似。

GST Pull-down技术是基于Pull-down实验原理，将诱饵蛋白与GST标签融合表达纯化，并固定在含谷胱甘肽（GSH）的琼脂糖珠上，随后与蛋白样本共孵育，捕获互作蛋白。

注：GST Pull-down实验操作步骤，在网上和自媒体平台有多种版本。本文是我们根据实验室常用的试剂盒操作手册整理的，仅做操作示范，不一定适合所有实验室。建议大家结合自己实验室的实际情况或按照正在使用的试剂盒说明书进行调整。

GST-融合蛋白可以通过大肠杆菌、杆状病毒-昆虫细胞等系统表达或其他已纯化的蛋白制备。我们已常用的大肠杆菌表达系统为例：

（1）按照标准操作方案培养并转化大肠杆菌。将构建好的载体（常用PET、PGEX系列）转入BL21菌株中，PCR检测确定转化成功。将BL21在LB或2×YT培养基中扩大培养，OD=0.6-0.8时，加入适量的IPTG。

注：不同靶点的蛋白表达条件可能存在差异，建议通过小规模预实验进行优化，比如IPTG浓度、诱导时长、诱导温度甚至摇床转速等。

（2）将5 mL经IPTG诱导的大肠杆菌培养液转移至无菌离心管。5000×g离心5分钟，弃去上清。

注：若GST融合蛋白的表达水平较低，可增加该用量。建议在此步骤取少量样品进行SDS-PAGE电泳，检测沉淀中的诱饵蛋白表达情况。

（3）加入1 mL TBS重悬沉淀，用移液器或涡旋振荡器混匀。将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，5000×g离心5分钟，弃去上清。

（4）加入200μL预冷的TBS重悬沉淀，用移液器或涡旋振荡器混匀。

注：为防止蛋白降解，建议操作在冰上进行，并加入适量的蛋白酶抑制剂。

（5）加入200μL预冷的细胞裂解液，立即颠倒混匀。冰上孵育约30分钟，期间需多次颠倒离心管。

注：如果蛋白以包涵体形式存在，需用包涵体溶解专用试剂。为加快实验进程，可采用超声裂解细胞。冰上孵育期间可以进行“平衡谷胱甘肽琼脂糖”操作步骤。

（6）12000×g离心5分钟，使上清裂解液澄清。取上清至新的1.5 mL离心管中，置于冰上或冰箱。将此管标记为“GST-Bait裂解液”。

注：此反应体系为5mL原始培养液。若体系增大，相应试剂用量需增加。

· 平衡谷胱甘肽琼脂糖

准备足够数量的离心柱（如PierceTM）并做好标记，使每个实验均包含样品、未处理树脂阴性对照和空载体阴性对照。将TBS和细胞裂解液按1:1体积比配成洗液，每个离心柱约需8-10 mL洗液。用涡旋振荡器重复重悬谷胱甘肽琼脂糖树脂，然后取50μL悬液移入离心柱中（树脂为50%悬液，每柱内树脂体积实为25μL）。

接着每个离心柱中加入400μL洗液。盖上盖子，颠倒数次以平衡树脂。移除盖子，将离心柱置于收集管中，1250×g离心30-60秒。弃去管中洗液，置于离心柱中，再加入400μL洗液平衡。重复5-6次，可保留首次洗涤后的液体用于分析。

· 固定诱饵蛋白

每个离心柱中加入300μL GST-诱饵融合蛋白裂解液，或100-150μg已纯化的GST标记融合蛋白。

注：需保留足够的裂解液用于SDS-PAGE分析融合蛋白的表达情况。需有需要可采用BCA或Bradford法测定裂解液的蛋白浓度。25μL谷胱甘肽琼脂糖树脂最多可结合200μg蛋白。

盖上离心柱的盖子，在4℃置于旋转平台上轻柔摇动，孵育30分钟以上。孵育时间需根据每一个靶点蛋白特性进行测试。

注：在此期间，可以进行“待测蛋白制备”，以缩短整个实验所需时间。

将柱子置于收集管中，1250×g离心30-60秒。将此收集管标记为“GST-Bait流穿液”，置于冰上或冰箱。每柱加入400μL洗液，颠倒数次混匀。将柱子置于收集管中，1250×g离心30-60秒。将此收集管标记为“GST-Bait洗液”，保存备用。重复洗涤5次。

待测蛋白可以通过大肠杆菌、杆状病毒-昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他表达系统制备，或者为已纯化好的蛋白。待测蛋白裂解液的制备操作与上文的GST-诱饵蛋白的制备一致。为获得理想的实验结果，建议在进行Pull-down之前，通过预实验确定待测蛋白的表达条件，比如培养时间、表达刺激条件等。

昆虫细胞裂解液制备与大肠杆菌基本相同，但需要将离心力有原来的5000×g降到500×g。来自哺乳动物细胞的裂解液制备差别较大，具体如下：

（1）按照标准操作方案培养哺乳动物细胞。将细胞培养液转移至无菌离心管，若为贴壁细胞使用胰蛋白酶消化。500×g离心5分钟，弃去上清。

（2）每5mL原始细胞培养液中加入1mL预冷的TBS，用移液器或涡旋振荡器混匀。500×g离心5分钟，弃去上清。

（3）按每克细胞湿重加入2.5mL冰冷TBS进行重悬。

（4）重悬后加入2.5mL冰冷的细胞裂解液，颠倒混匀。冰上孵育约30分钟，期间需多次颠倒离心管。

（5）12000×g离心5分钟，使上清裂解液澄清。取上清至新的离心管中，置于冰上或冰箱。将此管标记为“待测蛋白裂解液”。

（1）每个离心柱中最多加入800μL的待测蛋白样本。盖上离心柱的盖子，在4℃置于旋转平台上轻柔摇动，至少孵育1小时。取10-20μL孵育后的介质-蛋白混合液，标记为“Pull-down孵育液”。

（2）移除离心柱的盖子，将其置于收集管中，1250×g离心30-60秒。将此收集管中标记为“Pull-down留穿液”，置于冰上或冰箱保存备用。

（3）加入400μL洗液，重新盖好离心柱盖子，颠倒数次，使其充分混匀。

（4）移除离心柱的盖子，将其置于收集管中，1250×g离心30-60秒。将此收集管中标记为“Pull-down洗涤液”，置于冰上或冰箱保存备用。

（5）重复洗涤5次。

注：这里采用谷胱甘肽竞争性洗脱，利用高浓度的游离谷胱甘肽去竞争性结合GST蛋白复合物，将其从固相上置换下来。洗脱在温和、非变性条件下进行，有利于保留蛋白互作状态。

注：有些实验操作省去洗脱步骤，直接在树脂中加入等体积的2×SDS上样缓冲液。混匀后取100μL液体直接煮沸10min，制成WB样品。

（1）配制1 mL、10 mM的谷胱甘肽洗脱缓冲液：用分析天平称取3.1mg谷胱甘肽，用1mL的TBS进行溶解。

注：洗脱液应在每次实验前新鲜配制，用NaOH调pH至8.0。

（2）向离心柱中加入250μL洗脱液。盖上离心柱的盖子，在4℃置于旋转平台上轻柔摇动，孵育5分钟。

（3）将离心管置于收集管中，1250×g离心30-60秒。将此收集管中标记为“Pull-down洗脱液”，置于冰上或冰箱保存备用。

（4）制备SDS-PAGE或WB检测样品。取100μL Pull-down洗脱液，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，95℃煮沸5-10min，制成检测样品。

（5）进行SDS-PAGE和WB检测。