GST pull-down实验指南：从对照设计到结果判读，蛋白互作必掌握

Pull-down空载体、阴性、阳性对照有什么功能呢？又该如何设置？杂带多、无目的条带、重复性差、结果不会分析这一系列问题，我们都将在这一篇文章中解决。

实验的可靠性离不开严谨的对照设计，用于区分特异性相互作用及非特异性背景吸附，具体如下：

排除靶蛋白与GST标签本身不存在特异性结合。

设置方法：构建仅表达GST标签的表达载体，与GST-诱饵融合蛋白同条件诱导、表达、纯化。取与实验组摩尔量相当的GST纯化蛋白结合到相同量的谷胱甘肽珠上。加入与实验组完全相同量的靶蛋白，在相同条件下进行孵育、洗涤、洗脱，并同步进行WB检测。

排除靶蛋白直接吸附到Beads上的非特异性结合。一般在靶蛋白疏水性强、易发生非特异性吸附或GST对照组出现弱背景时，需要该对照进一步验证。

设置方法：仅加入与实验组等量的谷胱甘肽亲和Beads，不加GST融合蛋白，其它孵育、洗涤、洗脱、检测等步骤与实验组完全一样。

验证靶蛋白是否正常表达，排除因蛋白降解或未表达导致的假阴性结果。

设置方法：在进行磁珠孵育前，取5%-10%待测样本用作Input，直接加入蛋白上样缓冲液变性，与Pull-down洗脱产物同胶电泳、WB检测。

排除诱饵蛋白序列本身的非特异性疏水、电荷结合，适用于首次发现新互作或GST对照组存在弱背景时。

设置方法：选择与靶蛋白功能、家族完全无关的蛋白进行GST融合表达，比如GST-GFP、GST-MBP。保证蛋白量与标签对照、实验组一致，其余流程完全相同。

验证不同实验组间GST融合诱饵蛋白的用量一致，排除诱饵蛋白量不同导致的结合信号差异。

设置方法：

· 方法1：在与Beads固定前，各组取等量的GST融合诱饵蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。

· 方法2：Pull-dowm洗脱后，用WB检测各组洗脱的诱饵蛋白量，作为上样校正。

使用细胞裂解液作为靶蛋白来源时，验证不同组Input总蛋白上样量的一致。

设置方法：用GAPDH、Actin等管家蛋白抗体进行WB检测Input样品，作为上样内参。

验证实验体系有效，确认操作、试剂和检测体系均正常工作。

设置方法：选择已被文献广泛验证的蛋白互作作为阳性对照，优先选择亲和力与待研究互作相近的组合。阳性对照与实验组同批次操作。

接下来，我们结合具体文章中的结果图，对Pull-down结果进行解读分享。

源自文献：doi: 10.1161/CIRCRESAHA.115.306829

 

研究人员在HEK293T细胞转染表达TCF4-Flag蛋白后进行裂解，将裂解液与GST或GST-Bach1蛋白进行Pull-down共孵育，洗脱与GST结合的蛋白，通过FLAG抗体进行WB检测。结果显示GST-Bach1融合蛋白能捕获裂解液中的TCF4蛋白，而GST空载体不能捕获，说明Bach1和TCF4蛋白存在互作。

 

具体来说，实验分为

 

· 对照组（左侧泳道）：GST空载体为阴性对照，排除GST标签/beads非特异性结合。

 

· 实验组（右侧泳道）：GST-Bach1融合蛋白与TCF4-Flag蛋白共孵育。

 

GST pull-down洗脱复合物通过FLAG抗体进行免疫印迹检测。因TCF4蛋白带有FLAG标签，所以FLAG条带表示存在TCF4蛋白。图中显示，对照组没有TCF4，实验组有，说明GST空载体不能通过GSH亲和树脂捕获TCF4，TCF4的存在与Bach1融合蛋白有关，说明TCF4与Bach1互作。

 

Input用于确定起始样本中是否含有目的蛋白，来自孵育前含有捕获蛋白预留的一小部分样品，具体取决于实验体系。结果显示两条泳道中有信号相近的TCF4蛋白，说明两组实验中都有可检测的TCF4蛋白，排除目的蛋白不表达的影响。

 

图片最下方是对GST标签进行的检测，说明对照组有GST标签蛋白，实验组有GST-Bach1融合蛋白，但是图中没有分子量标尺，不能确定是SDS-PAGE电泳结果还是WB检测结果。

 

三、常见问题汇总

 

问题	可能原因	解决方案
蛋白表达低	表达条件需优化	预实验确定IPTG诱导浓度、时间、培养温度等条件
背景高或有较多条带	树脂洗涤不充分	增加洗涤次数或者提供洗液的离子强度
未检测到蛋白互作	互作弱或瞬时	减少洗涤次数，优化孵育条件（如4℃过夜）
	待测蛋白表达水平低	纯化或富集靶蛋白
	抗体特异性差	捕获蛋白融合His、FLAG等标签，用标签抗体进行WB检测
树脂有气泡	操作不规范	如离心时需要移除离心柱的顶盖