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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
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公司新闻/正文
经典技术Co-IP的「战场边界」：7类科研案例中的应用全景
45 人阅读发布时间：2026-10-16 15:52
免疫共沉淀（Co-IP）是“经典中的经典”，有哪些场景呢？我们继续结合7类科研案例，认识Co-IP的“战场边界”。
前情提要请看这篇文章：从“富集目标蛋白”到“解析互作机制”：免疫共沉淀Co-IP的7类核心应用与研究案例
五、分析翻译后修饰
蛋白表达量没有发生变化，并不代表其功能没有改变。磷酸化、泛素化、乙酰化等翻译后修饰会直接改变蛋白的活性、定位、稳定性及相互作用。
NLRP3炎症小体是固有免疫的关键复合物，由NLRP3、ASC和caspase-1组成，外源微生物、内源性分子或环境刺激可将其激活，诱导促炎细胞因子释放和细胞焦亡。Zhang等人发现NLRP3的激活过程发生赖氨酸乙酰化。为验证第二激活信号（如ATP、MSU、Imiquimod、nigericin等）是否诱导NLRP3发生乙酰化修饰，研究人员进行了Co-IP实验。
源自文献：doi: 10.1038/s41467-023-44203-0
研究人员利用NLRP3抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀，并通过乙酰化赖氨酸（acetyl-K）抗体检测NLRP3乙酰化水平。结果显示，单独LPS刺激未明显诱导NLRP3乙酰化，而在加入ATP、MSU或Imiquimod等第二激活信号后，NLRP3沉淀物中的乙酰化信号明显增强，此外，与NLRC4炎症小体激活剂flagellin及AIM2炎症小体激活剂poly(dA:dT)相比，nigericin诱导的NLRP3激活能够显著促进乙酰化，表明该修饰具有NLRP3炎症小体特异性。实验结果表明，NLRP3乙酰化主要发生于激活信号诱导阶段，而非单纯的LPS预激活阶段。
我们解读此类Co-IP结果，要先看Input总蛋白检测结果，靶蛋白（NLRP3）在各泳道具有条带且亮度均匀，说明蛋白表达成功，实验体系稳定。接着确认免疫沉淀是否成功，Anti-NLRP3免疫沉淀复合物经WB检测均可检测到NLRP3信号，而IgG阴性对照组未出现条带，说明检测到的信号具有特异性。
我们需要重点分析acetyl-K检测结果，确定被拉下来的NLRP3在哪种情况下发生了乙酰化变化。结果显示，LPS单独处理时NLRP3乙酰化信号较弱。而LPS联合ATP、MSU、Imiquimod等第二激活信号后，acetyl-K条带明显增强，说明NLRP3乙酰化需要第二激活信号。进一步比较不同刺激条件发现，LPS联合flagellin（NLRC4激活剂）和poly(dA:dT)（AIM2激活剂）未明显增强乙酰化，提示乙酰化修饰与NLRP3炎症小体激活具有一定特异性。
六、解析PROTAC等靶向蛋白降解机制
靶向蛋白降解技术（以PROTAC为例）同时结合靶蛋白与E3泛素连接酶，形成三元复合物，促使靶蛋白发生泛素化并被蛋白酶体降解。利用Co-IP可直接验证药物处理后靶蛋白与连接酶是否形成复合物，进一步通过富集靶蛋白检测泛素化水平是否升高。再结合蛋白酶体抑制剂等实验建立“E3招募-泛素化-蛋白降解”的机制探究。
c-Myc是一种关键的致癌转录因子，与高达70%的人类癌症发生、发展及耐药相关，但由于其蛋白结构固有无序、缺乏明确的配体结合“口袋”、“深居”于细胞核，抗体类大分子难以实现胞内靶向，属于传统意义上的“不可成药”靶点。PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）技术是“破局之选”。适配体对靶蛋白的结合口袋无特殊要求，且分子量小、可穿透至细胞核。Yuchun Wang等人基于适配体开发了高效的c-Myc降解剂ProMyc，不仅能降解c-Myc还显著降低其伙伴蛋白Max的水平，协同抑制c-Myc的转录活性。研究人员用Co-IP证实ProMyc能招募CRBN与c-Myc形成三元复合物，增加c-Myc的泛素化。使用蛋白酶体抑制剂（MG132）或CRBN敲低均可减少c-Myc的降解。
源自文献：Doi: 10.1002/advs.202309639
这组图从转录水平排除、蛋白互作、泛素化修饰、通路阻断到细胞成像，多维度验证了ProMyc降解c-Myc的分子机制，证明ProMyc通过招募E3泛素连接酶CRBN，促使c-Myc发生多聚泛素化，进而通过蛋白酶体途径降解c-Myc。
ProMyc不影响c-Myc的mRNA水平，排除转录水平干扰（图a）。用不同浓度（0、25、50nM）的ProMyc处理HCT116细胞，在24h、48h、72h提取RNA，qRT-PCR检测结果显示，不同时间点、不同浓度间mRNA水平无统计学差异，说明ProMyc不影响mRNA基因的转录和稳定性，排除了转录抑制导致蛋白减少的可能性，证明c-Myc蛋白水平下调是翻译后调控的结果。
Co-IP验证ProMyc介导c-Myc与CRBN三元复合物的形成（图b）。研究人员在HEK-293T细胞中共转染c-Myc-His和CRBN-Flag，分别加入失活的mutProMyc或ProMyc。用FLAG抗体进行Co-IP，分别用FLAG和His抗体进行WB检测。全细胞裂解液（Input）结果显示CRBN-Flag、c-Myc-His总表达量相当，ProMyc不影响蛋白表达。IP:Flag结果显示，加入ProMyc后c-Myc才会被CRBN共沉淀下来，加入mutProMyc的组别无相互作用。结果说明ProMyc特异性介导蛋白互作，形成“c-Myc-ProMyc-CRBN”三元复合物，失去活性将无法介导互作。游离的Pomalidomide竞争性结合CRBN，破坏ProMyc-CRBN-c-Myc三元复合物的形成（图c）。
ProMyc促进c-Myc的多聚泛素化（图d）。HCT116细胞共转染HA-Ub和His-c-Myc，加入mutProMyc或ProMyc，用c-Myc抗体进行Co-IP，然后用Ub抗体进行WB检测。Input显示c-Myc和β-actin表达一致，且泛素化条带在两组间无差异。IP: c-Myc结果显示，ProMyc组出现了明显的高分子量弥散条带，而mutProMyc组无此现象，说明ProMyc直接促进了c-Myc发生多聚泛素化修饰。
进一步实验发现泛素化抑制剂MLN4924（图e）和蛋白酶体抑制剂MG132（图f）阻断c-Myc降解，说明ProMyc介导的c-Myc降解依赖于Cullin-RING E3泛素连接酶的泛素化活性，泛素化后的c-Myc通过26S蛋白酶体途径被降解。最后通过免疫荧光直观验证ProMyc的胞内降解效应，其细胞核内红色荧光显著减弱。而抑制抑制E3酶活性、阻断蛋白酶体、竞争性结合CRBN均可逆转c-Myc降解，与上述实验结果一致。
七、评价药物对蛋白互作的影响
药物作用可能不改变蛋白质的表达量，而是通过改变蛋白构象或修饰状态影响复合物的稳定性，Co-IP可以通过检测复合物组分变化进行评估。例如以蛋白质互作为靶点的药物p53-MDM2抑制剂Nutlin、BCL-2-BAX抑制剂Venetoclax，可用Co-IP直观证明药物是否影响靶蛋白对的结合。通过梯度浓度药物处理，可分析药物对蛋白互作调控的浓度依赖性，反映药物在细胞水平的活性趋势。Co-IP可在耐药研究中，对比药物敏感株与耐药株中靶蛋白复合物的差异，探究耐药机制或者发现新的代偿性互作通路。
结直肠癌（CRC）BRAF V600E突变会造成患者预后差，抑制剂维莫非尼（Vemurafenib）易产生耐药性。Hu等人对ARF1-IQGAP1-ERK信号轴进行研究，并筛选出该蛋白互作的新型抑制剂LY2835219。ARF1是Ras家族小G蛋白，通过GFP激活参与囊泡运输。IQGAP1作为支架蛋白结合ARF1，促进ERK信号激活与CRC生长。研究人员通过Co-IP在细胞内验证LY2835219能够破坏ARF1与IQGAP1互作，为其发挥抗肿瘤作用提供直接的分子证据。
源自文献：doi: 10.1016/j.jare.2022.11.006（图中LY2839219为笔误，应统一为LY2835219）
研究在3种结直肠癌细胞系中进行，分别用LY2835219和DMSO进行处理，并且通过正反Co-IP和浓度梯度设计进行多方面验证。
· HCT116：CRC研究中广泛使用的人结直肠腺癌细胞系，属于MSI-H亚型，携带KRAS G13D、PIK3CA等突变，本实验中为普通非耐药型细胞模型。
· RKO：MSI-H亚型，携带BRAF V600E激活突变，对BRAF抑制剂维莫非尼敏感，标准亲本细胞模型，本实验作为耐药株的实验对照。
· RKO-VR：维莫非尼耐药性RKO细胞系（RKO-vemurafenib resistant），是研究人员通过高浓度维莫非尼（100μm）持续筛选RKO细胞，诱导产生的获得性耐药株。
· LY2835219：美国国家癌症研究所（NCI）药物词典将其列为Abemaciclib（阿贝西利）的代号，为CDK4/6抑制剂。通过核对全文内容及实验方法部分，LY2839219为笔误。
· DMSO：代表未受药物干预的天然生理状态。
用IQGAP1抗体进行免疫沉淀（图D），三种细胞系的Input总蛋白均能检测出IQGAP1和ARF1蛋白条带，说明细胞表达正常。DMSO组中，IQGAP1抗体均能有效免疫沉淀IQGAP1，且能共沉淀出清晰的ARF1条带，说明在普通和耐药性CRC细胞中，IQGAP1和ARF1存在互作。
与DMSO组相比，LY2835219处理后，HCT116细胞中的IQGAP1没有大幅降低，但共沉淀的ARF1几乎没有条带，说明药物减弱了两者间的结合能力。RKO和RKO-VR细胞的Co-IP结果类似，说明即使在耐药性细胞中，LY2835219也能破坏两者间的互作。
研究人员进一步设计了剂量依赖性验证，分析0μM（DMSO对照）、1μM、2μM、3μM对蛋白互作的影响，并以ARF1抗体进行反向Co-IP验证。Input结果显示，随着LY2835219浓度升高，细胞中IQGAP1、ARF1的总蛋白水平均无明显变化，说明抑制剂不是通过下调蛋白表达来发挥作用。在0μM对照组中，ARF1抗体磁珠成功沉淀ARF1和IQGAP1蛋白。正反双向Co-IP证实两者存在互作。随着药物浓度从1μM甚至3μM，ARF1蛋白量基本稳定，共沉淀的IQGAP1条带呈梯度减弱，浓度越高结合的IQGAP1越少。在耐药性细胞中，同样呈现出剂量依赖性抑制，随着药物浓度升高而增强。