竞争型TR-FRET：治疗性单抗与ADC亲和力检测的高通量新方案

在抗体药物研发、诊断试剂开发和基础免疫学研究中，抗体亲和力（通常以解离常数 K_D 表示）是评估抗体活性与功能的核心指标。高亲和力抗体通常具有更强的靶标结合能力，可提高抗原识别效率，并有助于提升抗体在治疗和检测应用中的性能表现。

如何实现高通量、快速检测亲和力已成为抗体筛选与评估的基本需求。TR-FRET采用均相、免洗的检测形式，无需标记或固定待测抗体，移液即读，适配自动化操作。义翘神州SwiftFluo^® TR-FRET系列产品，包括即用型试剂盒、标签工具试剂、常用缓冲液及各类耗材，支持灵活组合，用于多种应用场景的检测方法开发。

表面等离子体共振（SPR）技术无需荧光标记、实时动态监测、高灵敏度，是抗体亲和力与结合动力学分析的常用方法。SPR可提供结合与解离过程的数据，为抗体药物的筛选和优化提供依据。SPR通量较低、成本较高，在大批量样本评估中受限。

酶联免疫吸附实验（ELISA）操作简便、成本较低、设备门槛低，常用于抗体结合活性初筛。其检测灵敏度低于SPR，无法实时捕捉结合动力学过程，仅能检测终点信号。ELISA需通过数学模型估算抗体解离常数，不能直接提供结合与解离速率信息。

对于治疗性单抗和ADC快速增长的研发与质控需求，亟需一种高通量、高灵敏度、可自动化的亲和力检测方案。TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）技术，均相、免洗，兼容自动化操作，无需对分析物进行任何修饰，最低可评估低至个位数皮摩尔级别的亲和力。同时，该方法在抗体药物偶联物（ADC）开发中也具有应用价值。TR-FRET可作为低成本、高通量亲和力检测的补充或替代方案，为治疗性抗体的发现与生产提供助力。

2024年，贝勒医学院研究者在文章《Evaluation of High Affinity Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates by Homogenous Time-Resolved FRET》中，建立了一种竞争型TR-FRET检测方法，可对结合共同抗原的抗体药物进行相对亲和力排序，并展示了该方法在ADC工艺和样本处理条件评价中的应用。

TR-FRET将荧光共振能量转移与时间分辨荧光检测相结合。当供体与受体足够接近时（7-10 nm），供体被激发后可发生荧光共振能量转移。检测特定波长的信号比值即可确定待测物含量。

在竞争型TR-FRET检测方法中，研究人员以AF488标记的曲妥珠单抗Fab´片段、带His标签的HER2重组胞外结构域（ECD）蛋白和Tb标记的His抗体构建检测体系。Fab´与HER2结合后，使荧光供体Tb与受体AF488接近，产生TR-FRET信号。加入待测单抗或ADC后，待测分子与Fab´，竞争结合HER2，信号随竞争置换降低。通过待测分子的浓度梯度和竞争曲线拟合，可获得表观平衡抑制常数K_I，用于比较样本的相对结合强度。

竞争型TR-FRET检测原理（源自文献：Doi: 10.1021/acsmedchemlett）

1，均相免洗，高通量并行

TR-FRET检测在溶液相中完成，无需将待测抗体或抗原固定于固相，也无需复杂的样本前处理或洗涤。微孔板形式便于自动化移液和并行检测，可扩张性强。与SPR、BLI等固相技术相比，更容易实现“移液即读”的高通量筛选。

2，灵敏度高，可达个位数pM

待测单抗或ADC样本不需要荧光标记或表面固定，亲和力检测就可低至个位数皮摩尔级别，满足生物医药开发的高灵敏度需求。

3，时间分辨读数，降低背景干扰

TR-FRET通过延迟检测长寿命的荧光信号，降低了背景干扰和信噪比。但时间分辨检测不能完全排除荧光淬灭等干扰，仍需结合试剂浓度优化和对照进行判断。

4，仪器普及，成本可控

TR-FRET检测所需的仪器已非常普及，比如多功能酶标仪，可适配抗体研究领域快速增长的使用需求。实验操作较简单，成本可控，不仅可用于初筛阶段的大规模筛选，还能用于抗体类药物生产环节的质量控制。

5，避免钩状效应，减少假性结果

在SPR（直接法）中会出现“钩状效应（Hook Effect）”，即随着抗原浓度升高，抗原-抗体复合物大量形成，检测信号反而下降，导致剂量曲线出现拐点，产生常见的I型（假阳性）或II型（假阴性）错误结果。竞争型TR-FRET方法可以避免钩状效应导致的假性结果。

直接结合与竞争检测模型所得速率常数的比较（源自文献：Doi: 10.1021/acsmedchemlett）

1，竞争探针的选择与适用范围

方法依赖于能够与待测抗体竞争结合抗原的标记探针，需选择高亲和力、性能稳定的Fab或纳米抗体等探针。开发高质量的探针需要时间和成本，需根据研究的靶点选择合适的探针。

2，孵育温度与平衡时间

为稳定复合物的高亲和力，所有实验需在4℃进行，且平衡时间长达18-40小时。而SPR通常在室温或接近生理稳定下进行，孵育时间通常为1-2小时。过长的孵育时间是TR-FRET技术在高通量筛选应用中的主要瓶颈，胜在微孔板并行检测和自动化操作。

3，试剂浓度与荧光干扰

应优化标记探针、抗原及辅助检测抗体的浓度范围，并设置背景和非特异性结合对照。供体淬灭等光物理干扰也可能改变信号，需在方法开发中加以评估，避免将荧光信号变化直接解释为结合活性变化。

4，提供相对结合活性数据

竞争型TR-FRET测定的是平衡抑制常数（K_I），并通过竞争置换来排序。它不能直接提供结合（K_A）和解离（K_D）速率常数。结合排序和相关亲和力数据能满足抗体筛选与质量控制的需求。如果需要进一步了解结合与解离过程的动力学，可以结合SPR、BLI等进行表征。

义翘神州SwiftFluo^® TR-FRET提供常用标签工具试剂、缓冲液及各类耗材，支持灵活组合，开发竞争型TR-FRET抗体亲和力检测方法，用于抗体药物筛选与质控。同时，提供抗体筛选、细胞因子检测、激酶活性检测、cAMP含量检测等即用型试剂盒产品，适用于高通量检测。

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