高分文章中的标签Co-IP图怎么读？从Input到IB:FLAG逐步分析蛋白互作机制

上一篇我们把内源性Co-IP结果图完整拆了一遍，相信小伙伴们已经能照着“Input-IP-IB-IgG”的顺序把图读顺溜了。接下来我们继续「以图代练」，换一个更常见、也更容易出错的场景——标签Co-IP。

 

为何要单拎出来？因为我们经常会遇到Bait拉不下来、Prey没有条带、背景一片花儿。这时，我们给Bait蛋白挂上Flag、HA、Myc、V5、GFP等标签，再用标签抗体beads去免疫沉淀，就会将内源蛋白表达量低或者没有合适IP抗体的诱饵蛋白“钓”出来。

 

 

一、标准版：中规中矩

 

这是一张标准的外源性过表达体系的免疫共沉淀（Co-IP）实验结果图，用于初步验证HHEX与TEAD4在细胞内是否存在蛋白-蛋白相互作用。实验采用Flag、HA两种不同来源、不同表位的标签，避免一抗交叉反应。以“仅表达HHEX、不表达TEAD4”为阴性对照，是标签Co-IP常用的对照设置思路，用于排除非特异性结合。Input同时检测目标蛋白和内参蛋白，验证蛋白表达水平和上样均一性。整体条带清晰、杂带少、背景低，结果可信。接下来我们逐项拆解分析。

这是验证EDR1与EDR4之间是否存在互作的结果图。对照组表达游离GFP（分子量大小25KD）和EDR1-FLAG蛋白，为了排除GFP标签与EDR1、抗体或磁珠非特异性吸附导致的假阳性。实验组表达EDR4-GFP和EDR1-FLAG蛋白，不表达游离的GFP标签。实验以FLAG标签抗体沉淀EDR1蛋白及其结合的复合物，再用GFP抗体检测复合物中是否存在EDR4-GFP。如果能检测到则说明EDR1和EDR4之间存在蛋白互作。

观察图片的顺序与Co-IP实验操作顺序相同。

· Input组：这是免疫沉淀前的细胞总蛋白样品，验证两组样本中蛋白是否正常表达和上样量是否一致。以FLAG标签抗体进行WB检测，对照组和实验组均有130KD的条带，说明两组实验都成功表达EDR1-FLAG蛋白。而以GFP标签抗体进行检测，对照组仅表达游离的GFP，实验组同样仅表达EDR4-GFP融合蛋白。结果证明细胞按实验设计正确表达目的蛋白。

· IP组：验证免疫沉淀是否成功。两组实验结果显示均有FLAG条带且亮度相近，说明EDR1-FLAG被高效沉淀下来，沉淀效率无差异。

· Co-IP组：在IP组基础上，对FLAG沉淀下来的复合物用GFP抗体进行WB检测。对照组没有条带，实验组仅在130KD处有条带。说明免疫沉淀没有把GFP标签蛋白共沉淀下来，但把EDR4-GFP共沉淀下来了。对照组证实游离GFP不会带来假阳性，实验组证实EDR1和EDR4蛋白间存在互作。

源自文献：doi: 10.1038/s41420-024-02025-z

本实验分别对两个标签融合蛋白进行融合表达，增加了FLAG标签对照。这是验证FLAG标签免疫沉淀成功的阳性对照。还有一点是图片省去了“Input”标注，仅标注为“IB: Myc/FLAG”。

实验整体设计思路：以融合FLAG标签的IPO5（分子量约124kDa）为诱饵蛋白，PD-L1（33kDa）为猎物蛋白。免疫沉淀选用FLAG抗体磁珠，WB检测分别为FLAG抗体和Myc抗体。实验分别设置单表达Myc-PD-L1为阴性对照，单表达FLAG-IPO5为阳性对照，两种蛋白共表达为实验组。

总蛋白“Input”未标注，分别用Myc抗体和FLAG抗体进行WB检测。IB: Myc结果显示，阴性对照和实验组均表达Myc-PD-L1蛋白，阳性对照（即中间泳道）有弱条带，一般解读为非特异性条带，不影响实验结果判读。IB: FLAG结果显示阳性对照和实验组有特异性IPO5条带。

IP复合物也是分别用Myc抗体和FLAG抗体进行WB检测。IB: Myc结果显示，实验组有PD-L1蛋白条带。IB: FLAG结果显示阳性对照和实验组有IPO5条带。结果证实IPO5和PD-L1之间存在蛋白-蛋白互作。

单向Co-IP可能存在假阳性风险，建议进行双向Co-IP。将两个蛋白分别带上不同的标签，分别做诱饵蛋白进行沉淀。如果均能捕获到对方，就能有力支持两者在细胞内互作的结论。

源自文献：doi: 10.52601/bpr.2025.250057

这是一张双向Co-IP的WB结果图，目的是验证在HEK293T细胞内，非洲猪瘟病毒（ASFV）E2泛素结合酶I215L与宿主蛋白FAM105A存在互作。

标签及实验体系“初印象”：

从图中可以看出，总蛋白表达正常。共转染质粒均表达两种蛋白，单转染质粒仅表达对应标签的融合蛋白。

图A用Myc抗体及磁珠进行IP沉淀，沉淀复合物分别用Flag和Myc抗体进行WB检测。对照组的Flag仅有微弱的背景条带，无Myc特异性条带，说明Flag-I215L蛋白不会特异性吸附到Myc抗体磁珠上。实验组有很强的Flag条带，说明Myc-FAM105A与Flag-I215L存在互作。大家可以尝试用同样的思路来分析图B，反向验证FAM105A与I215L间存在相互作用。

源自文献：doi: 10.1371/journal.pone.0207315

这张图片出自PLOS ONE期刊，用于比较人Nibrin（NBN）与酵母Xrs2和人源MRE11-RAD50复合体的蛋白互作差异。MRN复合体是细胞响应DNA双链断裂（DSB）的核心元件。人源MRN复合体由MRE11、RAD50和NBN三个亚基组成。Xrs2是酵母MRX（同人源MRN）复合体的中NBN的同源亚基。

研究设计Flag标签Nibrin蛋白以及经过密码子优化可在人源细胞稳定表达的Flag-XRS2蛋白。空白对照（con）不表达标签蛋白。实验通过Flag标签抗体磁珠富集标签融合的诱饵蛋白，并通过Flag抗体、Mre11抗体和RAD50抗体进行WB检测。

Mre11抗体WB检测裂解液（Lysates）总蛋白表达量，3个泳道条带亮度基本相当。用Flag抗体检测IP混合物，阴性对照（Con）无条带，说明IP实验无非特异性结合。Flag-Nibrin条带清晰，被IP有效富集。Flag-XRS2条带信号更强，说明XRS2在人细胞中成功表达，且IP富集效率良好。

两种诱饵蛋白都成功被磁珠捕获，具备WB进一步分析的基础。

我们先来看Mre11抗体检测IP产物的结果，阴性对照无条带符合实验预期。Flag-Nibrin泳道可见Mre11条带，说明人Nibrin可高效结合Mre11并被拉下，符合MRN复合体已知组成信息。Flag-XRS2泳道没有Mre11条带，结合标签抗体检测结果，说明Xrs2蛋白表达丰度尽管很高，但不能共沉淀人Mre11蛋白。

按照同样的思路来分析RAD50抗体抗体的WB实验结果，可以得出结论：Flag-Nibrin拉下的复合物中有RAD50蛋白，而酵母Xrs2无法与RAD50蛋白形成稳定的复合物。总之，在人源细胞过表达体系中，人Nibrin能够与Mre11、RAD50形成稳定的MRN复合体，可被Co-IP检出，而酵母Xrs2在本实验条件下不能与Mre11、RAD50形成稳定的复合物。

同样的在最后，我们放上了一张图，欢迎感兴趣的小伙伴来解读。

源自文献：Doi: 10.1038/srep17554