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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
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公司新闻/正文
蛋白互作怎么“拉”出来？免疫共沉淀Co-IP实验从设计、实操到问题排查
230 人阅读发布时间：2026-09-17 11:06
受体激活后的信号复合物组装、转录因子与调控蛋白的结合、炎症小体及泛素化等多亚基蛋白的形成，构成了生命活动的分子基础。确认“蛋白A是否与蛋白B发生作用”是机制研究中的基本问题。
免疫共沉淀（Co-IP）是蛋白互作验证应用广泛的方法之一。其设计思路也很简单：在非变性温和裂解条件下保留细胞内天然蛋白复合物，利用特异性抗体捕获诱饵蛋白（Bait），同时将与之形成复合物的猎物蛋白（Prey）“钓”出来，然后进行WB或质谱检测。
但真正做过Co-IP的小伙伴会发现，这个实验的难点不在于把蛋白“拉”出来，而是如何保留真实蛋白复合物和尽可能去除非特异性结合。我们要避免因原理不清除、操作不细致造成杂带多、条带弱甚至无信号等异常结果。
接下来我们就对实验的原理、设计、实操步骤、常见异常等进行逐一探讨。
一、实验开始前，先回答“我要验证什么？”
免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）的基本原理：在温和非变性条件下裂解细胞，保留细胞内天然存在的蛋白复合物，用诱饵蛋白（Bait）的特异性抗体进行捕获，然后用Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠（beads）将“抗体-Bait-Prey”复合物共同沉淀下来，洗脱后进行WB（验证已知互作蛋白）或质谱（筛选未知互作蛋白）检测。
被IP抗体直接识别并富集的蛋白是Bait（诱饵），随其一起沉淀下来的并在后续WB中进行检测的是候选互作蛋白Prey（猎物）。为增强互作证据，我们一般需要进行反向Co-IP，即将Bait与Prey的角色互换一下，对应的抗体也要换一换。比如我们要验证蛋白A是否与蛋白B互作，可进行：
· IP：A→IB：B
反向Co-IP
· IP：B→IB：A
IP（免疫沉淀，常用磁珠或琼脂糖珠）表示用什么抗体把蛋白复合物拉下来，IB（免疫印迹，常用WB）表示用什么抗体去检测沉淀物中的蛋白。
需要注意，两个方向的结果会存在差异，因为蛋白丰度、抗体亲和力、表位位置等不相同。尤其是天然状态下，抗体识别表位可能被蛋白折叠或结合遮挡。出现表位遮蔽建议尝试识别Bait蛋白不同表位的抗体。
内源与外源的区别在于Bait蛋白的来源，内源Co-IP使用细胞或组织天然表达的蛋白，外源Co-IP使用体外基因转染技术表达的带有标签的重组蛋白。
内源Co-IP直接裂解细胞，验证天然状态下的互作，反映真实的生理互作，但难以检测低丰度蛋白、瞬时互作和弱互作。
外源Co-IP（也称为标签Co-IP）让Bait蛋白带有HA、Flag、Myc、GFP等标签，然后使用针对这些标签的抗体进行沉淀，将带标签的Bait及其互作蛋白“钓”出来。外源Co-IP捕获条件更稳定、标准化，信号强，易检测，适用于大规模筛选和发现新的互作蛋白。但过表达可能导致假阳性，需要内源Co-IP验证。
常用的高质量的蛋白互作研究设计思路：
过表达/Tag体系发现并优化互作→内源Co-IP再次验证→结合其他方法回答是否直接结合及其功能意义
二、Co-IP实验操作步骤
全程在冰上或4℃低温环境操作。样品尽量新鲜制备并立即使用，必要时可-80℃保存，避免反复冻融。
采用温和非变性裂解体系以保留蛋白生理互作。裂解液不含SDS，常用含0.1-0.5%的NP-40、Triton X-100、IGEPAL CA-630、CHAPS等。需现用现加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂。
1.贴壁细胞直接弃去培养基，用预冷PBS洗涤细胞2-3次。悬浮细胞需移至预冷的离心管中，4℃、300-500g 离心5min，小心弃去培养基，加入预冷的PBS轻轻吹打重悬细胞沉淀，然后离心，重复1-2次。最后彻底吸干残留液体。
2.按细胞量加入预冷的裂解液。每107个细胞、10cm培养皿或150 cm2培养瓶加1mL，每5×106个细胞、6cm培养皿或75cm2培养瓶加0.5mL。
3.先在冰上裂解10min，用细胞刮刮下后转移至1.5ml EP管中。然后冰上裂解30-60min，其间可每10min涡旋混匀一次，或4℃水平摇床缓慢晃动30-60min。若是核蛋白或膜蛋白，可冰浴超声2-3次，每次3-5s，至溶液澄清。
4.4℃、12,000-16,000rpm离心5-15min，取上清。
组织样本裂解
1.用预冷的PBS清洗新鲜组织，去除血液、体液等杂质。
2.取0.1-0.2g组织置于研钵中，加液氮充分研磨。
取出30-100μL上清作为Input先放入-20℃或-80℃冰箱，备用。
先处理Protein A/G beads（琼脂糖微珠或磁珠），用PBS洗两遍微珠，再用PBS配制成50%（v/v）浓度。
取1mL裂解物上清，加入100μL 50%的微珠，4℃孵育10-30min。4℃，12,000-16,000rpm离心15min，或磁吸架静置30min。取上清进行后续实验。
用BCA或Bradford法测定蛋白浓度。用PBS将蛋白稀释到约1μg/μL。
需要将样品上清进行分组：实验组和对照组。实验组加入诱饵蛋白的IP应用抗体，对照组加入同型IgG（同种属同亚型），排除非特异性结合。
向上清中加入适量一抗。抗体用量需通过预实验（梯度稀释）或查阅文献和说明书确定。4℃旋转孵育4h或过夜。
取30-50μL预处理好的50%的微珠，加入到样品中。4℃旋转孵育4h或过夜。
Protein A/G是一种具有4个蛋白A和2个蛋白G抗体结合位点的工程改造重组蛋白。
琼脂糖微珠与磁珠的对比：
· 琼脂糖珠：需封闭、需离心、操作繁琐、背景高
· 磁珠：无需封闭、不用离心，大部分有颜色，易操作、背景低
洗液可以选用PBS、PBST、RIPA裂解液或其他细胞裂解液。
琼脂糖珠：14000rpm瞬时离心5s，弃上清，用800μL预冷的洗液洗涤。重复3次。
磁珠：将IP反应管置于磁力架上，将磁珠吸附至管壁。待溶液澄清后，将上清液去除，留磁珠。加1mL洗液。将反应管从磁力架取下，4℃旋转3-5min，混匀后再次洗涤。共需洗涤3次。
变性洗脱（用于WB检测）：
向微珠中加入50μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液（含β-巯基乙醇或DTT），振荡混匀后瞬离，95℃加热5-10min。如果是琼脂糖珠，可14000rpm离心2-5min。如果是磁珠可在磁力架静置1min。收集上清至新的EP管中，直接进行SDS-PAGE或WB检测，切胶条可以进行质谱。
非变性洗脱（保留蛋白活性）：
向微珠中加入40-50μL洗脱缓冲液，涡旋振荡20 s，室温洗脱10-15min。然后离心或置于磁力架。收集上清进行后续实验。
· Input：总蛋白阳性，说明样品有效
· IgG组：无/弱条带，排除非特异性结合
· 实验组：诱饵蛋白+猎物蛋白均阳性，说明蛋白间存在互作
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标签Co-IP失败对照排查表 |
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常见问题 |
可能原因 |
优先排查 |
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Input没有目的蛋白 |
未正常表达或检测失败 |
转染效率、表达量、蛋白降解、WB抗体 |
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Input正常无Bait蛋白 |
IP效率低或Bait未被捕获 |
磁珠活性、标签表达量、裂解条件、孵育时间 |
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有Bait蛋白但无Prey蛋白 |
无明显互作或存在假阴性 |
裂解/洗涤过强、Prey表达量、标签的影响 |
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阴性对照有Prey蛋白 |
非特异性结合或背景高 |
磁珠非特异吸附、蛋白上样多、洗涤强度弱、对照设计 |
三、常见问题及解决方案
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可能原因 |
解决方案 |
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蛋白表达量低 |
应先对靶蛋白表达量进行检测，或优化裂解条件 |
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互作弱或瞬时 |
延长抗体孵育时间，使用交联剂固定 |
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抗体与微珠结合差 |
选择合适的微珠 |
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目的蛋白未被洗脱 |
查看洗脱液的强度和pH值 |
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抗体选择不当或不工作 |
进行预实验，确定抗体适用于IP实验 |
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抗体不识别天然构象 |
改用标签Co-IP |
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可能原因 |
解决方案 |
| 蛋白降解 | 保证蛋白质抑制剂现用现配，使用新鲜样品 |
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洗涤不彻底 |
增加洗涤次数（4-6次）、提高洗液中盐离子（NaCl 300-500 nM）或去垢剂的浓度 |
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抗体非特异结合 |
减少抗体用量，换抗体试一试 |
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抗体浓度高 |
优化抗体使用量 |
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磁珠未封闭 |
用1-5%BSA封闭，进行预清除操作 |
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裂解不充分，蛋白聚集 |
样品超声处理后离心取上清（3次，每次5s） |
| 可能原因 | 解决方案 |
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抗体不识别天然构象的蛋白 |
换裂解液，或改用标签Co-IP |
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裂解液破坏互作 |
降低去污剂浓度（0.1% NP-40） |
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Beads结合效率低 |
增加Beads用量，检测其与抗体的匹配性 |
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相互作用瞬时/微弱 |
延长孵育时间，使用交联剂 |