你以为细胞刺激很简单？ELISpot实验刺激物暗藏玄机

1. 非特异性刺激物

几乎可以激活所有淋巴细胞，通常为有丝分裂原，如植物凝血素（PHA）、伴刀豆蛋白A（ConA）、离子酶素/佛波酯（Ionomycin/PMA）、细菌脂多糖（LPS）等。PHA和ConA为蛋白质，稳定性会差些，使用过程中避免反复冻融。Ionomycin/PMA、LPS为有机化合物，稳定性较好。

2. 特异性刺激物

主要包括三类：T细胞表位肽、重叠多肽库和蛋白质。T细胞表位肽无需APC的内化和加工，直接呈递给T细胞。每一条T细胞表位肽都有相对应的MHC分子，代表了一种特异性的细胞免疫，多条T细胞表位肽混合起来形成T细胞表位肽库或肽池。国际上通用的标准阳性刺激物CEF由32条多肽混合而成的肽池，分别取自人类巨细胞病毒（CMV）、人类疱疹病毒（EBV）和流感病毒。

20世纪80年代末，研究人员发现TCR可以识别嵌入NHC分子的短肽段，因此多肽用于T细胞刺激检测中。在细胞刺激方面，多肽比蛋白质更有优势。多肽可重复生产且纯度高，质量控制简单，无需蛋白质表达系统，内毒素含量易控制，可轻松涵盖目标序列变异体，还可以根据需求引入特定的翻译后修饰。

蛋白质或重组蛋白也可以作为细胞刺激物。蛋白质含有所有的T细胞表位肽信息，不需要考虑MHC的基因型，但是纯度难以保障。蛋白质纯度主要涉及两个方面：杂蛋白和内毒素。杂蛋白可能会造成非特异性刺激，造成实验孔背景深。内毒素对哺乳动物T细胞有强烈的免疫原刺激性。即时微量内毒素残留也会显著刺激细胞，产生非特异性斑点。因此建议选用哺乳动物细胞表达的蛋白，且在实验前测定内毒素含量。这里安利一款超低内毒素重组蛋白产品：义翘神州的ProPure® ET-free蛋白，内毒素含量低至0.05 EU/mg，甚至可达0.01 EU/mg，远低于USP <85>参考值（0.5 EU/mg）。

3. 多肽及肽池（Pools）设计

设计细胞刺激的最佳多肽是一项复杂工作，需要综合多个因素来确定多肽长度，如MHC呈递效率、目标细胞群体、目标氨基酸序列范围、核心表位长度、样品可获得性等。常用肽池有3种：覆盖整个蛋白质抗原的重叠肽池、涵盖变异序列的肽池和涵盖来自同一种生物多种T细胞刺激性多肽的肽池。

不同类型的肽池（珠子代表单个氨基酸，源自文献：ELISPOT Methods and Protocols）

15aa重叠11aa：设计完美重叠肽池的"数学密码"。

设计覆盖整个蛋白质的肽库，重点是多肽间的重叠足够，确保不遗漏潜在表位。如两条15个氨基酸长度的多肽之间重叠11个氨基酸，可保证任何12个氨基酸长度的序列片段至少存在于一条重叠的15多肽中，而任何11个氨基酸长度的肽段至少包含在两条15多肽中。因此由15个氨基酸长度、重叠11个氨基酸的多肽构成的蛋白质覆盖型肽库，能兼顾MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类分子刺激效果，已广泛用于多种场景。

覆盖整个蛋白质抗原的重叠肽池设计思路（源自文献：ELISPOT Methods and Protocols）

序列多样性是许多致病性病毒及肿瘤的标志特征。肿瘤体细胞突变会导致个体间或个体内出现显著的序列异质性，改变肿瘤的免疫识别机制，如TP53以鉴定出29881个体细胞突变。病毒中出现突变的情况更常见，如流感H1N1、H3N2不同毒株间会有一定数量的突变。无论是免疫监测还是疫苗接种效果监测，在设计肽池时都应考虑序列多样性，构建的肽池应覆盖毒株间或群体间序列变异的全部范围。如基于HXB2模型序列构建的传统HIV-Nef肽池（含49条多肽），对已有的3903条Nef序列覆盖度<10%，经优化后扩容到150条多肽，覆盖度可达51.8%。

从2400条到103条：SARS-CoV-2肽池设计的"减法"艺术。

构建覆盖蛋白质完整重叠肽池所需多肽数量庞大，在技术或经济上不可行，因此可以构建一个包含已知T细胞刺激性肽段的肽池。如下表所示，SARS-CoV-2的8种蛋白质总长度为9525个氨基酸。若采用抗原覆盖型肽池约需要2400条15个氨基酸的多肽（重叠11个氨基酸），实际构建的肽池包含103条T细胞刺激性肽段。虽然仅占原始氨基酸序列的13%，但能提供有效的T细胞刺激，是探索和监测T细胞反应的高效且经济的方法。