细胞活率低于90%，ELISpot基本白做！斑点异常全解析，3招拯救你的结果

1. 斑点过多或过少

在ELISpot实验中有多种因素能够影响斑点的形成，如细胞生长状态、密度，PVDF膜的材质或处理方式，包被抗体、检测抗体的质量，刺激物的特异性及刺激时间，洗板是否充分，以及内毒素污染、培养基不稳定、细胞凋亡等干扰因素。

优化建议：

✔ 通过预实验调整细胞数量、抗体浓度及孵育时间。

✔ 设立阴性对照、阳性对照。

2. 有空白区域

在早期ELISpot实验或需要包被捕获抗体的操作中常见，主要是PVDF膜活化的问题。比如膜质量问题、乙醇活化过程中发生渗漏。

优化建议：

✔ 选择预包被ELISpot，省去乙醇活化操作，用含有5%-10%胎牛血清（FBS）的无菌RPMI-1640培养基（200 µL /孔）对预包板进行处理，室温孵育至少30 min。

✔  乙醇处理后立即加水稀释，避免活化过度对膜造成损伤。

3. 背景颜色深

主要原因是洗板不充分，也可能是膜未完全干透就进行检测。

优化建议：

✔ 洗板要充分。每孔中加入200 μL无菌的PBS，浸泡1 min。然后弃掉孔内液体，拍干。重复洗板操作5次。

✔ 用预冷的PBS洗涤可减少背景信号。

✔ 需等PVDF膜板完全干透后再读板

4. 细胞凋亡对结果的影响

细胞凋亡或死亡会造成ELISpot实验结果高背景、无斑点。据统计细胞凋亡比例达到30%，结果将完全不会出现斑点。即使凋亡比例达到5%也会严重影响结果。

优化建议：

✔ 细胞制备及处理阶段，注意无菌操作，温和处理细胞保证细胞活率，洗涤细胞用预冷PBS减少细胞应激反应。

✔ 预孵育或者密度梯度离心去除死细胞后，再做ELISpot实验。

ELISpot实验操作不规范，也会造成背景深、边缘效应及斑点成团、模糊、减少等问题，详见下表汇总。

若想获得清晰、可靠的ELISpot结果，除了对原理的充分理解，更要把控实验操作细节。理想的ELISpot斑点通常呈圆形，具有致密的中心和向边缘逐渐变浅的“核晕”。而细胞碎片、非特异性结合造成的假斑点，常常形态不规则、边缘锐利或颜色不均一。

决定ELISpot实验成败的三大关键因素有：

1，细胞样品活力与状态

低活力或处理不当的细胞无法对刺激做出有效反应，导致斑点微弱或无斑点。血液来源的免疫细胞是ELISpot常用的样本类型，建议选择柠檬酸钠或肝素钠抗凝剂进行采血。Wield避免粒细胞污染，应在采血3 h内完成细胞培养。

对于冻存细胞，可在复苏后先置于新鲜培养基中，在37℃放置1 h或更长时间。镜检细胞，恢复圆润透亮状态后再进行后续的铺板培养。

2，设置正确的对照

ELISpot实验至少要设置3组对照：

· 背景对照组：不加细胞悬液和刺激物，仅加培养基，用于排除由试剂或其它介质产生的非特异性斑点。

· 阴性对照组：不加刺激物，加入和实验组细胞数量一样的细胞悬液，用于确认可自发分泌细胞因子的细胞个数。

· 阳性对照组：加入阳性刺激物，如刀豆蛋白A（ConA）。用于确定试剂盒的质量、操作步骤和细胞功能的完整性。

阳性刺激物种类较多，主要分为非特异性刺激物和特异性刺激物。非特异性刺激物可激活大部分免疫细胞，使其分泌细胞因子，如PHA、ConA、PMA、LPS等。特异性刺激物包括特异性肽池（Peptide pool）、特异性抗原蛋白（OVA）或肽段（CMV Peptide）等，需根据实验实际需求进行选择。

3，洗板是关键操作

在ELISpot实验，洗板操作包括低渗裂解细胞后、检测抗体孵育后及酶孵育后。每次洗板需要重复4-6次，且建议洗液浸泡1 min。充分洗板能有效减少背景着色，减少细胞碎片，让斑点清晰可数。