3分钟了解ELISPOT技术检测B细胞免疫应答的5大关键步骤

1. 外周血单个核细胞（PBMC）的采集、分离、冻存

本次实验采用Ficoll密度梯度离心法收集接种疫苗人群的PBMC，详细操作步骤可参考“解决PBMC制备难题，手把手教你Ficoll离心，让免疫学实验数据登上顶刊”一文。

2. PBMC细胞复苏

实验检测SARS-CoV-2抗原特异性IgG MBC的ELISPOT方案使用低温保存的PBMC，因此需要先将冻存细胞进行复苏。如果实验条件允许，建议使用新鲜分离的PBMC。

2.1 在RPMI培养基中添加DNA酶，37℃水浴中至少预热15min。

2.2 在15mL的离心管中加入100μL预热的RPMI培养基。

2.3 从液氮罐中取出PBMC（细胞浓度1×10⁷ Cells/mL），将其快速置于37℃水浴中，直至剩余少量冰。

2.4 迅速用70%乙醇擦拭冻存管，用移液器将冻存管中的PBMC移至含有RPMI培养基的离心管中。轻轻摇晃混匀。随后缓慢加入500μL预热的RPMI培养基。此步骤需在无菌条件下操作。

2.5 每隔1min向离心管中加入1mL的培养基，直至细胞悬液体积达到10mL。盖紧瓶盖，颠倒混匀5次，不要涡旋细胞悬液。

2.6 25℃下300×g离心7min，离心机加速刹车开启。

2.7 移除上清液，加入10mL培养基重悬细胞，颠倒混匀5次。

2.8 将离心管置于37℃水浴中，孵育细胞20min。每隔10min颠倒一次离心管。孵育结束后将离心管置于冰上7min。

2.9 4℃下300×g离心7min，离心机加速刹车开启。

2.10 小心移除上清，用1mL添加5%胎牛血清的RPMI培养基重悬细胞。

2.11 取新的50mL无菌离心管，将细胞过滤网置于离心管顶部。通过滤网，将细胞悬液从15mL离心中移至50mL离心管中。

2.12细胞计数：取12.5μL细胞悬液，加入200μL 1×PBS、37.5μL台盼蓝，充分混匀。取10μL样品进行细胞计数。

2.13 通过添加含有5%胎牛血清的RPMI培养基，将细胞浓度调整至2×10⁶ Cells/mL。

3. B细胞预刺激

ELISPOT实验定量检测MBC频率，需要在体外非特异性预刺激B细胞。本次实验选用Toll样受体（TLR）激动剂R848和重组人白细胞介素（IL）-2（rhIL-2）联合刺激。

3.1 在24孔无菌细胞培养板，每孔中加入2mL PBMC悬液（浓度为2×10⁶ Cells/mL），使每孔含有4×10⁶个细胞。

3.2 每孔加入20μL rhIL-2，终浓度为10ng/mL。然后向每孔加入2μL R848，使其终浓度达到1μg/mL。

3.3 37℃、5% CO₂培养箱中，孵育细胞72h。

4. ELISOPT板包被

抗原包被应在预刺激实验的第二天进行。

4.1 用磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）将SARS-CoV-2重组蛋白稀释至2μg/mL，将抗人总IgG捕获单克隆抗体（mAb MT91/145）稀释至15μg/mL。

4.2 PVDF膜在包被前需用乙醇活化。如Millipore公司的PVDF板应每孔加入50μL 70%乙醇处理，最长2分钟。乙醇处理后立即用PBS洗板，重复5次。

4.3 根据实验设计，在对应的孔中加入100μL 稀释后的重组蛋白，确保每种抗原的特异性检测至少设置4个复孔。设置对照孔，仅用100μL pH 7.4的PBS包被，作为阴性对照。设置总抗体IgG包被孔，每孔加入100μL 抗人总IgG捕获单克隆抗体。

4.4 用膜密封96孔板，4℃孵育过夜。

5. B细胞ELISPOT实验设置

5.1 预刺激步骤完成后，将同一受试者的所有培养基/细胞合并至一个15 mL离心管中（若细胞量较多，则使用50 mL离心管）。

5.2 细胞培养孔底或壁上可能黏附细胞，需向每孔中加入0.5mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA。并置于37℃、5% CO₂培养箱中10min，直至细胞脱落。

5.3 将每孔细胞-胰蛋白酶悬液移入相同样本对应的离心管中。

5.4 重复步骤5.2-5.3一次。

5.5 向每孔中加入0.5mL含有5%胎牛血清的RPMI培养基，上下吹打均匀。将每孔悬液移入相同样本对应的离心管中。

5.6 向每个离心管中添加含有5%胎牛血清的RPMI培养基，将其体积补足至10 mL。

5.7 4℃下300×g离心7min，离心机加速刹车开启。

5.8 在不扰动细胞沉淀的情况下移除上清液。然后用0.5mL含有5%胎牛血清的RPMI培养基重悬细胞。将细胞置于冰上。

5.9 每个样本取12.5μL细胞悬液进行细胞计数。并用含有5%胎牛血清的RPMI培养基，将细胞浓度调整至2×10⁶ Cells/mL。

5.10 提前一小时将预包被的ELISPOT板从4℃取出，进行封闭。

5.11 封闭：先弃去包被试剂，每孔加250μL无菌PBS，洗剂5次。每孔加200μL封闭液（添加10%胎牛血清的RPMI培养基）。在生物安全柜中室温孵育1h。

5.12 移除封闭液，将板在纸巾上拍干，直至ELISPOT板中无培养基残留（在生物安全柜中操作）。

5.13 每孔加100μL细胞悬液（浓度2×10⁶ Cells/mL），分别加入SARS-CoV-2 抗原包被孔和空白（无抗原）细胞对照孔中。

5.14 向100μL细胞悬液中加入900μL培养基，对细胞悬液额外进行1:10稀释。取50μL稀释后的细胞悬液（每孔1万个细胞）加入总IgG包被孔（例如每位受试者4个孔），再向总IgG包被孔中加入50μL含5%胎牛血清的RPMI培养基，使每孔总体积达到100μL。

5.15 用铝箔覆盖板，37℃、5% CO₂培养箱中，孵育细胞24h。孵育期间不要扰动细胞。

6. 记忆B细胞频率测定

6.1 低渗裂解细胞：从培养箱中取出ELISpot板，弃掉孔内液体，在滤纸上拍干。然后在每孔中加入200μL 4°C预冷的去离子水，置于4°C冰箱10min。

6.2 洗板：完成裂解后，弃掉孔内液体并拍干。接着每孔中加入200μL无菌的PBS，浸泡1min。然后弃掉孔内液体，拍干。重复洗板操作5次。

6.3 检测抗体孵育：每孔加入100μL稀释好的检测抗体，室温条件下孵育2h。

6.4 洗板：抗体孵育结束后，弃掉孔内液体并拍干。然后向每孔中加入200μL无菌的PBS进行洗板。重复洗板5次。

6.5 Streptavidin-ALP孵育：每孔加入100μL稀释好的Streptavidin-ALP，室温条件下孵育1h。

6.6 洗板：抗体孵育结束后，弃掉孔内液体并拍干。然后向每孔中加入200μL无菌的PBS进行洗板。重复洗板5次。

6.7 显色：每孔加入100μL底物显色液，室温避光孵育5-30 min，根据斑点生成情况选择终止显色时间。

Tips：显色反应通常发生在10-30 min，通过目视监测斑点的形成过程。

6.8 终止反应：待斑点出现后，用大量自来水或去离子水冲洗。建议揭开板底座，冲洗膜的底部。

6.9 读数：将ELISpot板放置在室温阴凉处，待板完全干燥后再进行读数。可使用斑点分析仪或显微镜进行斑点计数及分析。

Tips：请勿在高于37°C的温度下干燥膜板，否则可能导致膜破裂。斑点计数时，应注意区分由纤维、膜撕裂、碎片等导致的不规则斑点，一般细胞生成的斑点通常为圆形。