解决PBMC制备难题，手把手教你Ficoll离心，让免疫学实验数据登上顶刊

外周血单个核细胞（PBMC，Peripheral Blood Mononuclear Cells）是免疫学研究中最常用的样本之一，常作为WB、ELISA、ELISpot、流式细胞术等实验的研究对象。PBMC的特征是有一个圆形的细胞核，包括：

1. 淋巴细胞（约占PBMC的95%）：T细胞（70%）、B细胞（15%）、NK细胞（10%）

2. 单核细胞（5%）：分化为巨噬细胞和树突状细胞

3. 树突状细胞（1%）：功能强大的抗原呈递细胞

这些细胞不仅是ELISpot检测的核心对象，更是WB、流式细胞术等实验的常客。与组织来源的细胞不同，PBMC的获取无需杀死实验动物，仅需一管外周血即可开展研究，因此在人类免疫学研究、疫苗评价、肿瘤免疫治疗等领域具有不可替代的地位。

关键认知：PBMC的质量不是“有就行”，而是“好才行”。Dead cell=Dead data，这一公式应刻在每个免疫学研究者的心中。

PBMC是外周血中的重要细胞群体，能够代表外周血的免疫状态，是研究免疫系统、疾病机制和开发免疫疗法的重要工具。PBMC来自全血，常用蔗糖聚合物（Ficoll）密度梯度离心法制备，操作步骤如下：

1，实验前准备：Ficoll密度梯度介质提前恢复至室温（18-20℃）。

2，1:1稀释全血：将抗凝全血从采血管转移至新的无菌50 mL离心管中，加入等体积的PBS。轻轻颠倒管子，使血液和PBS混匀。

3，准备离心：取新的50 mL离心管，先加入15 mL Ficoll，再加入稀释后的15 mL血液。血液要缓慢的加入，可适当倾斜离心管，使移液器枪头紧靠管壁，位于Ficoll液面上5-10mm处，慢慢加入，避免Ficoll分离介质和血液界面搅乱，保持两种液体分界面清晰。

4，密度梯度离心：将离心管放入离心机，室温1000 x g离心30min。请注意：要关闭离心机的快升速和减速设置，防止升速或降速过快破坏液体分层。

5，收集PBMC：用移液器缓慢吸掉上层血浆层（约15mL）。然后从边缘开始，缓慢吸取PBMC层至新的离心管中。剩余的Ficoll和红细胞层可弃掉。

6，洗涤：在PBMC中加入5倍体积的PBS或培养基，室温300x g离心5-10min。小心弃去上清。为确保Ficoll彻底清除可重复洗涤一次。

7，重悬细胞：加入5-10mL培养基，轻柔吹打，重悬细胞。

Ficoll密度梯度离心的核心原理是利用细胞密度的差异来进行物理分层。PBMC的体积、形态和密度与外周血其他细胞不同。Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，不会穿过生物膜，可用于PBMC的分离液。Ficoll是通过特定的调整，密度保持在1.077 ± 0.001 g/mL。

如上图所示，红细胞、粒细胞密度大，离心后沉于管底。淋巴细胞、单核细胞密度小于Ficoll的密度，离心后漂浮于其上。Ficoll处于PBMCs与不需要的粒细胞和红细胞层之间，起到隔离的作用。因此吸取白膜层细胞，并进行合适的洗涤，就可从外周血中分离获得较高纯度的PBMC。

温度是“隐形杀手”。Ficoll的密度会随温度波动，最佳温度是室温（18-20℃）。室温条件下，红细胞与Ficoll有效聚集。温度过高会使PBMC中混入Ficoll，降低PBMC回收率。温度过低则会阻碍红细胞和粒细胞渗透到密度较高的Ficoll中，造成PBMC污染。因此，Ficoll密度梯度离心应在室温下进行。切记：离心机温度设为20℃，千万不要用4℃！

关于PBMC的冻存和复苏，可参考上一篇文章：《实操干货 | 小鼠脾细胞制备、冻存、复苏全流程详解》，这里我们不再赘述。

关键是做到“慢冻快融”！

冻存最佳降温速率为1℃/min，这能让细胞在冰晶形成和渗透压变化中找到生存平衡点。-80℃不是终点！细胞在此温度下仍有微弱代谢，长期储存会导致功能丧失。必须在24小时内转入液氮。

复苏后细胞常因DNA释放而聚团。在培养基中加入SuperNuclease^®等核酸酶，可有效解离细胞团块，提高回收率，且不影响ELISpot结果。

静脉穿刺是常用的采血方法，在操作时要采用一些适当的防护措施。

要想获得单个核细胞悬液，需对全血进行抗凝处理。3种常用的抗凝剂有EDTA、肝素、柠檬酸盐。研究已经证实，这3种抗凝剂均适用于PBMC制备，且在ELISpot检测中结果相近。采血与PBMC分离之间的时间间隔会显著影响ELISpot实验结果。有两个研究团队提供的证据表明，为获得最佳的ELISpot反应，需在采血后8小时内完成PBMC分离。而早在20世纪80年代就已有文献报道延迟血液处理所带来的负面影响。

建议使用新鲜血液样本，抽血后全血样本室温放置不宜超过5-8小时，不要冷藏。如需运输，样本应在环境温度下运送到所需的实验室。

血液样本储存超过20小时，PBMC可能会被活化的粒细胞污染。这将导致T细胞反应显着降低。防止这种污染的方法：

1. 在常温储存前，用PBS或RPMI-1640培养基1:1稀释血液样本；

2. 抽血后耗尽粒细胞；

轻轻混合血液样本，直到PBMC分离。

成功分离PBMC依赖于多种因素。其中在试管中加入蔗糖聚合物Ficoll时，不能与血液混合。可以如图所示提前加入Ficoll，如果是将Ficoll铺在血液上层，需要缓慢小心的移动液体。目前有预填充Ficoll（位于隔层下方）的多孔硬质隔层试管（如Leucosep或Accuspin试管），更方便这一步的操作。当获取血液后，可快速且轻松的将其加入试管，无需担心血液与Ficoll发生混合。与传统分层法相比，该方法能节省大量时间，且PBMC得率与传统方法相当。

核心问题在于：究竟是什么原因导致ELISpot检测结果下降？研究发现主要原因是粒细胞，它们会在采血后被激活。接下来我们将详细讨论一下相关的机制：

粒细胞被激活后其密度会发生改变，无法通过Ficoll密度梯度离心将其从PBMC中分离。因此相当于对PBMC进行了稀释，而斑点数的减少与粒细胞污染程度正相关，比如20%粒细胞污染=少加20% PBMC=少20%斑点。粒细胞在冷冻和解冻过程中会有大量死亡，出现细胞聚集效应，进一步影响ELISpot结果。

当粒细胞被接种到ELISpot板中时，还会通过自身Fc受体与捕获抗体的Fc段结合，粘附在膜上，对斑点造成物理性破坏。

粒细胞在采血后被激活，会释放过氧化氢，促使精氨酸酶激活，进而导致CD3 zeta链表达下调，干扰T细胞受体（TCR）的信号转导。这种机制是导致血液处理延迟后，在ELISpot检测结果中观察到T细胞功能受到抑制的根本原因。

那么有没有办法既能避免粒细胞污染又能减少其激活带来的影响呢？

关键的操作就是采血后快速分离PBMC。若在采血几小时后完成PBMC分离，可将粒细胞污染及其激活带来的影响控制在可控范围内。

McKenna及其同事深入研究了采血后不同处理场景下粒细胞的污染情况。

他们对同一个供体的不同管血液进行处理，结果显示，室温储存8小时后，PBMC中粒细胞的污染程度是采血后立即分离PBMC的两倍。

而室温储存24小时后再分离PBMC，其粒细胞污染会增加近10倍，若在4℃储存24小时，其污染会增加近100倍。

但是采血后立即用PBS或RPMI培养基将血液按1:1稀释，室温储存24小时，粒细胞污染程度会降低，与血液在室温储存8小时效果相当。血液稀释能降低粒细胞的激活，

因此，无法在8小时内完成PBMC分离可在无菌条件下对血液进行稀释。例如将血液稀释到预装PBS的50mL试管中，在室温下运输到实验室再进行后续的PBMC分离。该方法已获得国际糖尿病免疫学会（IDS）T细胞研讨会委员会的推荐。