「ELISA问诊室」标曲R2<0.99？你的ELISA数据正在“说谎”！看懂ELISA自查表，贴在冰箱保平安！

 

标准曲线是ELISA实验的核心，判断数据可靠性的第一道关卡。标准曲线是用已知浓度的标准品制作出来的“参考线”，是计算样本浓度的基础。

该怎么判断标准曲线是否符合要求呢？

首先看R²值是否符合要求。

R²值（R-squared，也称为决定系数）是衡量标准曲线拟合优度的重要指标。R2值范围从0到1。越接近1，说明标曲与实验数据之间的吻合度越高，拟合效果越好。在ELISA实验中，要求R²值≥0.99，确保标曲线性关系良好，结果可靠。如果低于0.95就可能存在加样不准、标准品失效、洗板不彻底等问题。 

其次看标准品OD值梯度变化是否明显。

标准品的OD值应按照浓度从高到低依次下降。如果某个浓度的OD值与上一浓度持平或下降太多，可能是操作失误。

第三看空白对照OD值是否满足足够低。

空白对照的OD值一般应小于0.1。如果空白值偏高，可能是清洗不彻底或者试剂浓度使用偏高，需要调整配比。

最后看实验设计是否有复孔。

ELISA实验要做复孔（一般2-3孔），两孔之间的差异用变异系数CV值评定。如果某个样品的复孔OD值一个天一个地，很可能是孔内有气泡、样品中有杂质或者枪头堵了。

比如假阳性，明明不该有数值却测出来了，原因可能是样品中有干扰物质（溶血、脂血）、非特异性结合、封闭不彻底，可以对样品进行稀释或更换封闭液。同理如果出现假阴性，则需要对样品进行浓缩、更换高灵敏度试剂盒或查看抗体有效期。

OD值并不是越高越好。如果样品的OD值“爆表”了，超过标曲最高点，算出来的浓度是不准确的，需要将样品进行稀释重测。当然，OD值趋于0也说明目的蛋白浓度太低，可能低于检测下限，可尝试对样品进行浓缩处理。

标准品可以看作是一系列已知目标蛋白浓度的阳性对照。如果能够看到标准品的信号，且其浓度降低时信号也会减弱，说明ELISA检测正常有效。反之，则需要调整ELISA的操作和检查试剂了。比如空白孔OD值＞0.1，可能是有一定的背景存在。

标准曲线无梯度或梯度不明显、读数过低或过高，可能由多种因素相关，比如标准品稀释不准确、加样或试剂操作不规范、洗涤操作不充分、交叉污染等等。具体分为以下几种情况：

1、标准品相关

主要存在的问题有标准品复溶不当、稀释配置错误、降解。

大多数标准品为冻干粉，在复溶时要严格按照说明书要求，使用指定的溶剂复溶。复溶后适当涡旋或静置一段时间，确保样品完全溶解。在倍比稀释时，要做好记录和标记。如有必要，可对移液器进行校准。避免反复冻融、长时间暴露在高温或不稳定环境中，小量分装再保存也是常规操作，请勿粗心大意。

 2、实验操作因素

可能存在的问题有移液不准、温育时间或温度不合适、洗板不充分、洗剂缓冲液污染等。

移液器需要定期校准，并确保移液器和枪头之间的高度密合性，加样时保持枪头垂直，缓慢加样，避免与孔壁接触。加样时避免液体溅出，造成孔间交叉污染。孵育应选用精准控温的设备，比如放在避光、无风的专用孵育箱。

3、试剂或仪器问题

可能涉及这些试剂或设备：酶标记物、底物、酶标仪等。

酶标记物保存不当、过期或受到污染，导致活性降低，影响显色反应，应在使用前检查其保质期和活性，发现异常及时更换。底物溶液也可能会存在同样的问题，应使用新鲜配制的底物溶液，并避光保存。酶标仪需定期校准和维护，选择合适的波长和检测范围进行OD值读数。

以上是ELISA操作翻车的常见情景，建议ELISA操作时定要详细阅读说明书，各种试剂做好平衡，稀释液要充分溶解混匀。另外对标准品设置复孔，可以更好的减少误差和绘制更佳的拟合标准曲线。

标准品最好采用倍比稀释法，浓度梯度至少有5个且有比较大的跨度，要涵盖所检测样品的范围（上限和下限）。在检测标准品OD值时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

最后，为大家准备了一个ELISA结果自查快速表（打印出来贴冰箱上）