「ELISA问诊室」复孔数据要“蹦迪”？四步分析法让你的CV值稳稳当当

1、样本问题（样品降解、杂质干扰、浓度不合适）

ELISA可检测样本范围十分广泛，比如血液（血清、血浆）、组织匀浆或提取物、细胞培养上清、细胞裂解液、分泌物（唾液、乳汁）、排泄物（尿液、大便）等，甚至还可以检测土壤中的蛋白样品。不同类型样本的处理方法也大相径庭。

新鲜样本要及时处理，并分装保存，避免反复冻融，造成样本降解。比如血液样本，要在采集后24小时内进行处理，收集和处理时要避免红细胞破裂溶血，不使用高血脂样本。整个过程避免细菌污染。所有样本收集后，应及时分装并储存于-20℃或-80℃。在检测前，冻存样本应缓慢恢复至室温。轻柔的混匀。如果有可见的沉淀需要再次离心去除。

样本浓度不宜过高或过低，OD值应在标准曲线范围内，最好是在中间段。浓度过高可进行倍比梯度稀释，计算浓度时乘以样本稀释倍数。如果浓度太低，可浓度样本，或者更换灵敏度更高的试剂盒。

2、操作细节（加样误差、孵育不足、洗板不当）

手动加样可能会存在误差，比如移液器未校准或操作不规范，枪头未插紧或有残留液体。不同操作人员加样手法不一样（如快吸快打）。所以要对实验人员进行标准化培训，加强基本功训练，还需定期校准移液器。

手抖党看这里！将移液器枪头45°贴壁，可以防止枪头抖动。还可以将手肘撑在桌面或超净台外边沿，使手臂、移液器和桌面之间形成三角，稳稳地加样。如果还手抖，可以用另一只手紧握持移液器手的手腕，使两个手臂和桌面之间形成稳固的三角。

孵育条件不稳定，比如温度波动较大，可能会造成板间CV值大。建议使用恒温孵育箱（37℃±0.5℃），精准控温控时，减少频繁开盖。孵育时要盖封板膜，减少孔内液体蒸发。

手动洗板时一般加入300-350μL 1X 洗涤液，静置30秒至1分钟后立即甩干，重复洗板3-5次。洗涤过程中，洗涤液不要溢出板孔，以免污染相邻的孔。特别是高浓度孔污染低浓度孔或空白孔，会造成复孔间CV值变大。

甩板时，手腕不要左右摇摆或旋转，应迅速翻转倒液，重复2-3次确保甩净。使用干净的吸水纸、滤纸或无尘布，不要使用卫生纸，细小粉尘或碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，影响复孔数值。

如果机洗，需要定期校准洗板机，检查洗板机是否有堵塞，确保每孔洗涤均匀。

3、试剂、耗材问题

抗体、酶标二抗或底物反复冻融也会导致活性下降，抗体批间差异大，会造成CV值大。所以抗体应分装保存，酶标抗体要避光保存，标准品倍比稀释液应现用现配。

酶标板的质量也存在差异，通过预实验确定板子的CV值是否达标。

4、仪器设备

定期校准酶标仪，确保波长与底物匹配，如TMB显色需要450nm波长。

标准曲线梯度应多于5个点，建议使用四参数logistic回归模型进行标曲拟合。

记住这个公式：

严谨的操作 × 标准化的流程 = 漂亮的CV值