「ELISA问诊室」为什么标准品优选重组蛋白？一文掌握ELISA实验标准品梯度设置技巧

重组蛋白是绝大多数双抗夹心法ELISA试剂盒标准品的选择，而非天然蛋白。因为天然蛋白在大多数细胞和组织中表达量较小，难以大批量生产制备，并且天然蛋白存在于复杂的生物样本中难纯化。而重组蛋白恰恰相反。

重组蛋白与天然蛋白具有很高的相似度，主要与蛋白表达体系有关，比如真核表达系统中的哺乳动物细胞平台，表达宿主有CHO（中国仓鼠卵巢细胞）和HEK293（人胚肾细胞），让重组蛋白表达更真实，更接近天然蛋白样本，具有更好的空间构象和生物活性，且易于标准化生产，不同批次间质量稳定。

重组蛋白纯度是ELISA标准品的关键指标参数。纯度通常通过SDS-PAGE或HPLC进行检测。高纯度蛋白可以减少其他非靶点蛋白或杂质的干扰信号。因此，选择重组蛋白时纯度越高越好（比如≥95%），但也需要根据实验目的选择合适的蛋白纯度。

ELISA基于抗原抗体免疫反应，需要标准品具有生物活性。ELISA 的EC50值常作为评估重组蛋白生物学活性的方法之一，EC50值越低，活性数据越好。同时内毒素含量、批间稳定性、热稳定性等指标也会影响ELISA标准品的性能。

标准品大多为重组蛋白的冻干粉，在使用前应根据说明书将其复溶 按照说明书要求加入一定体积的指定稀释液，上下颠倒混匀，或者振荡器低转速轻轻短暂震荡混匀。待充分溶解后，静置10-15分钟，使重组蛋白恢复其空间构象。室温静置还是冰上静置，请按说明书操作或咨询技术支持人员。然后进行分装冻存。

标准品工作液需要现用现配，如有剩余请弃用。一般标准品工作液会有6-8个不同的浓度，常设置成倍比梯度，如1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0 pg/mL。不同试剂盒或ELISA实验检测灵敏度不同，标准品工作液的浓度会存在差异。工作液的体积也可根据实验具体用量进行调整，比如500μL、300μL、200μL。

标准品工作液制备基本相同，以1000pg/mL初始浓度、配制8个浓度梯度、各500μL工作液为例，可按照如下操作进行：

原液建议复溶后分装，-80℃冻存，长时间室温放置要废弃。标准品倍比稀释液若一次未使用完，同样建议弃去。