「ELISA问诊室」洗板不到位，ELISA全报废？手腕翻转0.5秒甩干术大揭秘

洗涤液组成比较简单，一般由pH 7.4的PBS或TBS，加入0.05%-0.5%的Tween-20或Triton X-100组成。实验室常用PBS磷酸盐缓冲体系，但如果使用碱性磷酸酶系统（如AP）则需改为TBS缓冲液。去污剂常选用Tween-20，其浓度在不同的实验室会存在差异，但不能高于0.2%，否则会使特异性结合物解离，进而降低实验灵敏度。

商业化的ELISA试剂盒一般提供浓缩液，比如20X，可按照1:19的比例进行稀释，即取1mL浓缩液加入19mL去离子水稀释混匀，具体稀释量请根据实验用量配制，建议现用现配。本次实验未使用完的1X洗涤液可以弃去。稀释前应先观察恢复至室温的浓缩液是否有结晶，如有还请混匀或在37℃水浴锅中使其溶解。

虽然现在已经有样式多样的自动或智能洗板机，但是作为传统ELISA实验人，还是推崇手工洗板，可能是因为手工细胞灵活性更高吧。

手工洗板主要有以下步骤：

1）准备工作

用去离子水或蒸馏水将浓缩洗涤液稀释到1X，将多层吸水纸铺好，准备洗板操作区域。如果是使用商业化试剂盒，还请使用配套的洗涤液，请勿使用其他的，防止影响实验结果。

2）加液

使用多道移液器或排枪，每孔中加入300-350μL 1X 洗涤液。加液时要保持枪口悬空，避免划伤孔底或产生气泡。洗涤液不要飞溅或溢出，防止污染。

3）浸泡

按照预实验或试剂盒说明书要求，静置30秒至1分钟，让洗涤液与孔内壁充分接触，洗去未结合物。

4）倒液

体现技术活的时刻来了，操作要迅速、干脆，手腕不要左右摇摆，不能旋转倒液。用拇指按住ELISA板一侧的中间位置，用食指按照另一侧，从底部托起ELISA板。然后迅速翻转孔板，借助手臂的力量快速向下移动并突然停止。连贯的动作使液体借助惯性从孔板内甩出。手指、孔板条和板托外侧都不应沾上液体，重复这个倾倒动作一次。

5）拍板

均匀且有力的拍板3次，每次拍板可使孔板水平旋转180度，确保孔内无可见液体。每次均将孔板倒扣在铺有多层吸水纸的桌面上，每次拍板均要落在吸水纸未使用的区域。用干净的滤纸，不要用卫生纸，因为细小的粉尘或碎屑会吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，复孔差值也较大。拍板需要巧劲并不是力量越大越好，力度太大可能会使抗体抗原结合物解离。

6）完成一轮洗板操作后重复以上第2-5步。一般洗板次数为3-5次。最后一次拍板后用干净的滤纸擦拭孔板外部，清除残留的洗涤液。不要让孔板晾干，应尽快加入底物，防止酶活性受到影响。

与手工洗板相比，洗板机在效率、稳定性、适应性等方面优势较大。

首先将ELISA板置于洗板机上，并设置洗板程序：如加液量（每孔250-350μL）、浸泡时间（5-10分钟）、清洗次数（3-5次）。

然后启动程序，洗板机会自动完成加液、浸泡、倒液的全过程。

最后结束程序，取出ELISA板，并在干净的吸水纸上用力拍干。

总之，ELISA洗板机通过自动化和标准化的洗涤过程，有效提高实验的可靠性和效率，提升ELISA实验的成功率和准确性。

Q1：ELISA在哪些操作步骤之后需要洗板呢？

在ELISA实验中，除了最后的显色阶段外，其他操作几乎都需要洗板。比如：

1）包被之后：在抗原或抗体固定在孔板上，并完成孵育后需要进行洗板。目的是除去未与板孔结合的蛋白，防止这些游离的蛋白干扰后续实验结果。

2）封闭之后：用BSA、脱脂奶粉等封闭液完成封闭后，需要去除多余的封闭液。如果有封闭液残留会竞争结合检测抗体或样本中的蛋白，导致假阴性或信号偏低。

3）酶标板准备：商品化的预包被的酶标板在加入样品或标准品之前，需要进行洗板，确保板孔无杂质并增强结合活性。

4）一抗孵育之后：待测样本、标准品、特异性一抗完成孵育后，需要洗板除去未结合的蛋白、杂质等，这是降低背景噪声关键的一步。

5）二抗孵育之后：酶标二抗完成孵育后，进行洗板操作。目的是除去未与一抗结合的酶标二抗，降低背景信号。

总之，洗板作为ELISA实验中的关键步骤，几乎贯穿整个操作过程，仅加入底物后显示到加终止液两步不需要洗板。

Q2：洗板次数不足会怎样？

如果没有完全除去未结合的蛋白或抗体，将会造成背景信号高、非特异性结合，导致整板全蓝，出现假阳性。

Q3：过度洗板又会怎样呢？

过度洗板会洗掉已经结合的抗原抗体复合物，导致整体显色变弱、甚至“白板”。

Q4：哪些操作会造成孔间交叉污染？

1）在用多通道移液器或排枪添加洗剂液时，枪头伸到液面以下甚至戳到孔底。

2）洗涤液添加时飞溅或溢出到其他孔导致的污染。

3）在吸水纸的同一位置反复拍板。

Q5：不同试剂盒的洗涤液或者自己配的洗涤液可以混用吗？

不可以。洗涤液的主要成分虽然大差不离，但是在具体浓度上可能会存在差异。混用可能会与实验体系不适配，实验结果难预料。如果本试剂盒的洗涤液实在不够用，建议咨询产品的技术支持或查看说明书，充分了解洗涤液的组分及配比后再进行替换。

Q6：洗涤液浓缩液出现颗粒物或沉淀，是变质了吗？

不一定。浓缩液盐离子浓度相对较高，长期静置或4℃保存，可能会有结晶析出。建议在使用前轻轻摇晃或37℃水浴至完全溶解。