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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
入驻年限：17 年
- 联系人：
客服部
- 所在地区：
北京
- 业务范围：
技术服务、试剂、抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒
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生产厂商
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「ELISA问诊室」开端不迷茫：从包被缓冲液到特殊抗原，科研老司机总结的翻车自救指南！
154 人阅读发布时间：2026-03-25 14:35
ELISA是以96孔板为固相载体的免疫学实验技术，抗体筛选、效价测定、蛋白互作、诊断试剂开发等都需要它，几乎在任何实验室都能看到它的身影。
商品化的ELISA试剂盒基本是预包被抗体或抗原的，可直接用于实验操作，但大多数属于双抗夹心法，并不能满足实验室千变万化的ELISA实验需求。因此很多实验人员自己动手，“丰衣足食”，根据实验需求DIY酶标板。
「ELISA问诊室」第8期，将为大家介绍酶标板制备中的第一步操作——包被。
一、DIY自己的酶标板
酶标板的制备主要有包被、封闭、干燥三步操作。
包被是将抗原或抗体吸附到固相载体表面的过程，通过蛋白质结构上的疏水基团与载体表面的疏水基团相互作用力结合，属于非特异性物理吸附。这种吸附与蛋白质的分子量、等电点、浓度等有关。
包被需要选择合适的缓冲液。包被缓冲液一是维持蛋白质稳定性，避免其变性或聚集，二是提供合适的pH环境，使蛋白带正电荷，促进与带负电的固相载体结合。
传统的包被缓冲液是50 mM pH9.6的碳酸盐缓冲液。随着ELISA技术的发展，大家有了新的认知，一般会在酸性、中性、碱性缓冲液中进行筛选，以达到蛋白稳定性和包被效率间的平衡。
|
缓冲液类型 |
pH范围 |
优势 |
劣势 |
适用场景 |
|
碳酸盐缓冲液 |
9.2-9.6 |
高pH促进吸附，成本低 |
现用现配 |
大多数包被 |
|
PBS缓冲液 |
7.2-7.4 |
稳定性好 |
吸附力可能不足 |
耐碱性差的蛋白 |
|
Tris盐酸缓冲液 |
8.0-8.5 |
稳定性中等 |
吸附力中等 |
特殊结构蛋白，如膜蛋白 |
BH3O3缓冲液 |
8.5-9.2 |
吸附力强 |
配制复杂 |
难包被的疏水蛋白 |
附50 mM pH9.6的碳酸盐缓冲液配方：将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶解于去离子水中，定容至1000mL。
包被的时间和温度主要取决于ELISA的使用场景。如果是要快速得到验证性结论，可以在37℃包被2小时。如果是批量生产制备，考虑到板间差异需要低温过夜，一般是4℃包被过夜。包被的浓度与载体和包被物的性质有关，需要通过预实验确定，一般蛋白质的包被浓度为0.1-10 μg/mL。
|
包被条件 |
特点 |
适用场景 |
|
37℃ 2小时 |
快速高效 |
科研验证，稳定性高的抗原/抗体 |
|
4℃过夜 （16-18小时） |
包被温和，减少蛋白变性 |
批量生产，稳定性差的抗原/抗体 |
在准备好包被缓冲液后就可以进行包被了，一般用50 mM pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗体或蛋白质稀释至0.1-10 μg/mL。在每个酶标板反应孔中加100μL包被混合液，覆盖薄膜，4℃过夜或37℃ 2小时静置包被。
包被完成后需要清洗掉过量的或未牢固结合的组分，清洗次数需要摸索。一般操作为：每孔中加入300μL洗涤液（pH 7.4 PBS+0.05% Tween-20），浸泡30s-2min，然后倒液、拍板，重复3-5次。也可选择用洗板机洗涤。
洗板后还需进行封闭。在每个孔中加入200μL封闭液，用封口膜覆盖酶标板室温孵育1-2小时，洗板2-3次。封闭液可以是含5%脱脂奶粉PBS缓冲液，也可以是其他封闭剂，如BSA、酪蛋白、明胶、血清等。为了提高稳定性，有时会在封闭液中添加一定量的蔗糖或海藻糖。
二、固相载体就是酶标板
固相载体是ELISA实验中的支撑物和容器，不参与化学反应。固相载体样式主要有3种：微量滴定板、磁珠和小试管，其中以微量滴定板最为常用，即常说的酶标板。酶标板一般为96孔，分为整体式和可拆式。可拆式为8联孔条或12联孔条，方便少量样本的检测。
酶标板主要材质是PS，通过疏水键、离子键或共价结合，将抗原/抗体等吸附到孔内表面。PS具有较强吸附性能，且吸附其上的蛋白仍保留免疫学活性，价格经济实惠。PS会被有机溶剂或强酸强碱溶解，受紫外线照射易变色，在使用时应注意。
酶标板因原料和制作工艺的不同，吸附性、空白值、孔底透明度等会存在差异，因此，每一批次的酶标板在使用前应检查其性能。通常采用批间差抽检（抽样率≥2%）。比如用10ng/mL IgG包被1-2条酶标板或整板，洗板后加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体（如1:5000），孵育后洗板，加底物进行显色，终止酶反应后检测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔吸光值在0.8左右，所有孔的变异系数（CV）应小于10%，不同板间的CV应小于15%。
三、包被材料与方式
固相载体对蛋白质的吸附能力也不相同，大分子蛋白质比小分子含有更多疏水基团，更容易吸附到载体表面。IgG具有较强的吸附力，且多发生在Fc段，抗体结合位点会暴露在外，抗体包被可采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也采用此方案包被。
抗原决定簇在疏水区或邻近疏水区域时，直接吸附不能充分暴露抗原决定簇，需采用间接捕获包被法，原理类似双抗夹心法ELISA。先将靶向该抗原的特异性抗体进行预包被，然后通过抗原抗体反应使抗原固相。间接包被提高载体上抗原的纯度，因此杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，且此法能减少抗原用量，仅为直接包被的1/10或1/100。
不易吸附的非蛋白质需要采用特殊的包被方法。如检测抗DNA抗体时，可先用亲和素预包被，再加入生物素化的DNA完成包被。脂类物质无法与酶标板结合，可将其在有机溶剂（如乙醇）中溶解，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，酒精挥发后脂质自然结合在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA检测常采用这种包被方式。
包被，是大家开启ELISA科研之旅的第一步，将决定实验的成败。酶标板质量、包被缓冲液、抗原/抗体的纯度、特异性等都会影响包被效果，需要大家在操作时充分考虑。