「WB急救室」一文掌握Western Blot实验全流程操作步骤和关键试剂配制

101 人阅读发布时间：2026-03-25 13:25

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接下来，我们将按照WB实验步骤进行详细的汇总，并对试剂配方进行“大公开”。

01 实验步骤：（以悬浮培养细胞为例）

1. 收集细胞：3000 rpm，4℃离心5min，弃上清。PBS或PBST洗2遍。

2. 裂解细胞：按每106个细胞添加100-200 µl的比例，添加预冷的含有PMSF的裂解液。裂解液现用现配，冰上静置10-20分钟裂解细胞。建议进行超声裂解，将EP管放入冰水混合物的烧杯中，1.2秒超声，中间5秒间隔。超声后置冰上30分钟，期间每10分钟用振荡器振匀一下。

3. 收集上清：提前预冷离心机，4℃，12000 rpm离心10分钟，用移液枪吸取上清到新的冰上预冷的1.5mL离心管中。

4. 测定浓度：取原液或稀释样品，通过BCA法测定蛋白浓度（可选）。

5. 蛋白煮样：根据蛋白浓度确定检测蛋白上清体积，加入5X loading buffer，充分混匀后，用水浴锅或金属浴95-100℃处理5-10分钟。将样品置于冰上降温，可根据样品粘稠度进行瞬离。

6. 凝胶配制：根据目的蛋白大小制备8%-12%的SDS-PAGE凝胶。

7. 电泳：倒入1X电泳液，浸没梳子和玻璃板边缘后，双手平行缓慢拔出梳子。可用1mL移液枪吹每个上样孔的边缘和孔内，防止有残留碎胶堵住上样孔，影响条带形状。将10-15ul样品加入上样孔中。开始电泳，浓缩胶可选择80V 20-30分钟，分离胶调至100-120V，根据预染marker或溴酚蓝判断目的蛋白位置。

8. 转膜：5X8cm的PVDF膜基本可铺满整张凝胶。PVDF膜需要先在甲醇中激活30s，当然，现在也有用乙醇体系的。通过转膜仪将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上，90V或300mA，1.5-2小时。

9. 封闭：将PVDF膜含蛋白的一面朝上放，用5%脱脂奶粉或1% BSA，室温孵育1小时。

10. 一抗孵育：用一抗稀释液或含封闭液的PBS稀释抗体，4℃孵育过夜，或室温孵育2小时。

11. 洗板：用含有0.1% Tween-20的PBST洗3遍，每次5分钟。

12. 二抗孵育：用二抗稀释液或含封闭液的PBS稀释抗体，室温孵育1小时。

13. 洗板：用含有0.1% Tween-20的PBST洗3遍，每次5分钟。

14. 显影：显影液现用现配。

02 注意事项

1，防止蛋白样品裂解，样品提取过程需在冰上操作，所用设备、试剂要预冷。裂解之前在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂。建议用超声波裂解。

2，开启正式实验前，要充分了解目的蛋白的特性，尤其是条带大小、表达量、亚细胞定位等信息，并选择合适的特异性抗体。

3，为保证实验结果准确，可定量分析，建议测定蛋白浓度，采用等质量上样法。建议将样品稀释到相同的浓度，采用相同的上样体积。

4，电泳上样前一定要混匀样品。移液枪在快打完时放慢速度，防止产生气泡。

5，建议使用预染marker，可以及时掌握目的蛋白在电泳或转膜后的位置，检测电泳进度和预估转膜效率。

6，分离胶最下层边缘一般是不均匀的，建议转膜时裁切掉。

7，提前配好转膜液，并在4℃预冷。转膜前仔细检查是否存在气泡，必要时可用玻璃棒滚一滚，以排除气泡。

8，在倒有转膜液的托盘中按顺序制作“三明治”：（黑-）海绵1张→滤纸3张→凝胶→PVDF膜→滤纸3张→海绵1张（白+）。口诀为：“黑胶白膜”！

9，小分子蛋白使用0.22μm的膜，大分子0.45μm，转膜时推荐使用横流转。

10，脱脂奶粉一定要混匀，不能有未溶解的渣渣，建议用滤膜过滤。

11，期刊杂志常要求提供整膜原始数据，要提前了解目标期刊的具体要求，选择合适的抗体孵育模式：整膜或裁膜。

03 WB试剂配方大全

1，1XPBS缓冲液

PBS缓冲液广泛用于蛋白抗体实验和生物学研究中，是细胞培养、免疫印迹、免疫荧光等实验的理想选择。

试剂组分	用量
NaCl	8g
KCl	0.2g
Na2HPO4	1.44g
KH2PO4	0.24g
先在干净无菌的容器中加入700-800mL去离子水，然后将准确称量的试剂组分依次加入水中，边加边搅拌。待溶液中无固体呈透明状后，再用NaOH或HCl调pH值。一般PBS缓冲液的pH值在7.2至7.6之间。然后用去离子水将体积补足至1L。最后用0.22微米的滤器过滤PBS缓冲液，以确保无菌。建议分装至小瓶进行保存。