「WB急救室」助你完美提取蛋白样品，解决WB实验难题（Protocol汇总）

1，收集细胞，3000 rpm，4℃离心5min，弃上清。

2，加入1ml预冷的PBS，将细胞重悬。将细胞悬浮液移至2ml EP管中。注意要用手指肚轻弹重悬。如果用移液器，要注意轻柔吹打，先从旁边吸取PBS，进行吹打。

3，3000 rpm，4℃离心5min，弃上清。

4，按每10⁶个细胞添加100-200 µl的比例，添加预冷的含有PMSF的裂解液。用移液枪将细胞重悬，尽量混匀。将EP管放入冰水混合物的烧杯中，1.2秒超声，中间5秒间隔。超声后置冰上30分钟，期间每10分钟用振荡器振匀一下。

5，BCA法对蛋白溶液进行定量。

6，加入Loading buffer，混匀后，在沸水中煮10min。煮完后冰上冷却，用振荡器混匀20秒。若粘稠，可继续超声，5"或5"×5。

7，立即电泳或分装保存。

1，倒掉细胞培养液，将培养瓶倒扣在吸水纸上，使吸水纸吸干培养液，或将瓶直立放置使残余培养液流到瓶底，然后用移液器吸走。

2，使用胰酶将贴壁细胞消化下来，把细胞收集到2ml EP管中。3000rpm，4℃离心5min，弃上清。

3，加入1ml预冷的PBS，将细胞重悬，然后离心。重复两次。

4，加入预冷的裂解液进行超声。

5，后续操作步骤按照悬浮细胞提取进行。

1，由于受刺激物的影响，一些细胞脱落下来，需要先收集细胞。将培养液倒至15ml离心管中，3000rpm，4℃离心5min。

2，弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后再离心。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3，加入1ml预冷的PBS，将细胞重悬，将细胞悬浮液移至2ml EP管中。

4，后续操作步骤按照悬浮细胞提取进行。

1，动物处死后迅速取出目标组织，用预冷的PBS或生理盐水冲洗干净，去除血液和结缔组织。用滤纸吸干多余的液体后，立即将组织切成尽可能小的块。

2，组织破碎仪的适配器需要在﹣20°C预冷30min以上。

3，按100mg加1ml裂解液（含PMSF）的比例加入适量裂解液。拧紧盖，破碎条件60-70HZ，30-40s。

4，破碎好的组织放入低温离心机中，14000rpm，4℃离心1min，消除破碎带来的泡沫。

5，放在冰上裂解30min。

6，14000rpm，4℃离心10min，取上清。

细胞中浆蛋白的提取

1，收集细胞，3000rpm，4℃离心5min，弃上清。

2，加入1ml预冷的PBS，将细胞重悬，将细胞悬浮液移至2ml EP管中。

3，3000rpm，4℃离心5min，弃上清。

4，按照每10⁶个细胞添加100-200 µl的比例，添加预冷Buffer A，重悬。4℃放置10min，离心。

5，弃上清，按照1.5×10⁷个细胞加入500µl Buffer B，重悬。4℃放置3min，离心（5000rpm，4℃离心5min）。

6，吸取上清。上清为浆蛋白。

细胞中核蛋白的提取

7，在沉淀中加入Buffer C，按照1.5×10⁷个细胞加入500µl Buffer C，重悬。4℃放置3-5min，5000rpm离心1min，弃上清，12000rpm离心30s，完全吸净上清。

8，沉淀中加入50 µl Buffer D，重悬。超声处理（1.2"×5）。4℃放置30min，每隔10min振荡一次。

9，12000rpm，4℃离心10min，取上清，即为核蛋白。

Buffer A的配制：

Buffer B的配制（2 ml）：

Buffer C的配制：

Buffer D的配制（2 ml）：

1，收集细胞，1100rpm，4℃离心5min。

2，用4℃预冷的PBS重悬，将细胞移至1.5ml EP管中，PBS洗一遍。

3，按照按照1×10⁷个细胞加入300 µl RIPA裂解液，裂解液中添加PMSF（1:100）和Aprotinin（1:1000）。超声裂解，冰上放置15-30min。

4，13000rpm，4℃离心10-15min。

5，将离心后的上清转移至新的预冷的1.5ml EP管中，冰上备用（总蛋白）。

6，用PBS重悬沉淀。

7，加入尿素裂解液10-15 µl，冰上裂解10min

8，13000rpm，4℃离心10min，弃上清。

9，沉淀用90 µl Buffer A溶解，获得核基质蛋白。

尿素裂解液配方（pH 8.0）

Buffer A配方