「WB急救室」文献中的WB实验图总是看不懂？这套“拆解法”建议收藏，10秒速判WB结果是否可信？

Western Blot结果到底长啥样？

四步快速解读WB图

一张标准的WB结果图，主要展示四方面的信息：

基于WB图展示的主要信息，我们总结了“四步拆读法”。以上文图片为例，一步步把WB图看透、看懂。

Step 1：看“主角的起起伏伏”

本次研究的目的蛋白是γH2AX。通过结果图可以看出，出现亨廷顿病（HD）症状的R6/2小鼠模型的脑组织（ctx、str）中γH2AX条带要比正常小鼠（野生型（WT））演示更深，说明在亨廷顿病中γH2AX的表达量会升高。

γH2AX目前是国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热门蛋白靶点之一。染色质的基本结构蛋白是核小体，核小体由DNA和组蛋白（Histone）组成，组蛋白包括H2A、H2B、H3和H4。H2AX是H2A的变体，在DNA发生双链断裂（DSBs）时，H2AX被磷酸化为γH2AX。在DNA修复后，γH2AX会快速发生去磷酸化。因此，γH2AX是经典的DNA损伤或修复的标志物。

Step 2：看内参“标尺”

内参蛋白条带情况很重要。如果条带清晰可见，亮度均一，说明实验过程中样品处理、电泳、转膜、抗体孵育等步骤操作正确，实验质量较高。如果目的蛋白的条带比内参条带弱，说明目的蛋白表达量相对较低。

在磷酸化蛋白WB实验中，会设置双内参，同时检测样本中对应靶点的总蛋白量。通过计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值，检测蛋白质磷酸化水平。同时也可以区分总蛋白表达量与磷酸化蛋白之间的关系，是总蛋白表达量增加引起的磷酸化水平升高？还是总蛋白表达量没有变化仅是磷酸化水平发生变化？

本研究的内参是β-actin，图中显示内参条带颜色灰度一致，条带位置大小正确，说明实验操作无偏差，实验结果可信。无论是野生型还是HD型，目的蛋白γH2AX的表达量远远低于内参蛋白。

Step 3：看对照怎么设置

确定分组及处理条件：文献中会详细描述实验组和对照组的设置，如刺激物名称、作用机制、处理条件、处理时间等。不同样本处理方法中，“+”表示进行处理，“—”表示未进行处理。观察时多进行两两比较，分析不同处理方法对目的蛋白表达情况的影响。

本研究的对照有两个维度：WT vs HD、ctx vs str。其中WT和HD分别对应正常型（即野生型）和具有亨廷顿病症状的R6/2小鼠，ctx和str分别表示大脑皮层和纹状体区。

Step 4：看条带位置

首先内参蛋白大小正确（约43kDa），其次目的蛋白的大小符合预期。目的蛋白和内参蛋白的名称及其分子量大小，是验证实验结果准确性的关键信息。

通过图注还可以了解到本次研究至少进行了3次重复验证，并将实验结果数字化。t检测结果显示HD模型中ctx和str存在显著的DNA双链断裂，且纹状体损伤更严重，进一步支持HD神经元DNA损伤增加的病理机制（p<0.001）。

统计图中的一些重点

Western blot结果统计图，常用柱形图，可以直观地比较不同组别之间的蛋白质表达情况。

柱状图的高度表示蛋白的相对含量。如图中纵坐标是OD（pixel unit）值。在Image J类的作图软件中，OD（光密度值）表示像素颜色的深浅程度，与条带灰度值呈负相关。灰度值越高，则像素越白，OD值越小；灰度值越低，则像素越黑，OD值越大。

柱形图中常用的是将数据进行归一化处理。具体来说是将原始数据通过某种算法或公式转换到一个新的范围内，通常是0-1或-1到1之间。目的是消除不同评价指标的量纲和取值范围差异带来的影响，让数据值都在同一个量级，便于后续处理和分析。比如各组数据除以对照组的数值，将对照组设置为1。

统计图中还有一个重要的数据指标：显著性水平。

这类数据处理是为了更方便比较实验组与对照组之间的差异，图中的*、#表示组间的统计学差异性。一般*代表p<0.05，**代表p<0.01，以此类推。p值与显著性的关系非常密切，通常我们设置一个阈值（例如0.05），当p值小于或等于该阈值时，认为结果显著。如果p值大于该阈值，则认为结果不显著。无统计学意义的可标注n.s.或NS。

为了方便大家更好的理解不同显著性检验方法的特点，我们对四种常用方法进行了对比展示：

误差棒（Error Bar）是软件计算得到的，不是自己画上去的“T”。

误差棒是数据可视化的一部分，直观地展示数据的波动范围和不确定性，确定数据的可靠性和统计显著性。误差棒通常以垂直线或横线的形式出现在柱形图、线图或散点图中。

误差棒的长度表示数据的误差范围。较长的误差棒表示数据波动较大，较短的误差棒则表示数据较为集中。常见的误差棒有标准差、标准误差、置信区间等数据统计量。

文献中的WB图片虽然多种多样，但不会偏离以上这些基本要素。找对方法，沉着冷静，再难再复杂的WB图片也能快速看懂。