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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
入驻年限：17 年
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「WB急救室」从样品制备到结果分析，磷酸化蛋白WB全流程优化方案（值得收藏！）
206 人阅读发布时间：2026-03-25 11:39
蛋白质磷酸化修饰是信号转导的核心机制，对揭示生命奥秘和疾病机制至关重要。但是Western Blot（WB）检测磷酸化蛋白堪称科研界的“噩梦级操作”。低丰度、易降解、动态变化……往往会造成WB结果：
条带弱
无条带
高背景
杂带多
……
任何一个环节的失误都可能导致实验失败！
「WB急救室」第23期，本文将结合文献资料及实操技巧，为你梳理从样品制备到结果分析的全流程优化方案，助你轻松搞定磷酸化蛋白WB！
01 样品制备——决定成败的第一步
磷酸化蛋白检测面临两大挑战：
低丰度：磷酸化蛋白仅占总蛋白的1%-10%。细胞不同的生长状况或处于特定细胞周期时，其仅占可能更少。
去磷酸化：蛋白磷酸化修饰是可逆的。细胞裂解的瞬间会释放蛋白酶和磷酸酶，几毫秒内就可能导致磷酸基团被去除；
因此，磷酸化蛋白WB能否成功的关键在于蛋白样品的质量。保证样品新鲜度至关重要，建议尽快处理。
2. 冷：所有试剂、耗材提前4℃预冷，离心机调至4℃预冷，整个过程在冰上操作
3. 准：确定刺激条件，如药物浓度、处理时间
细胞样品可以在35-40%功率下进行3次超声破碎，每次1-2秒，每次间隔5-10秒，整个过程冰浴操作。组织样品的研磨，需要用液氮预冷研钵。
样品在测定浓度后，可以加入上样缓冲液，并分装冻存于-80℃，避免反复冻融导致磷酸基团的降解。
当然，在实验开始之前要充分了解自己的研究对象。需要通过查阅相关文献或数据库获取蛋白磷酸化位点和水平，如UniProtKB、Phospho SitePlus、qPTM等数据库，输入蛋白分子名，可查询该蛋白的各种修饰类型、位点信息及其他相关数据。根据磷酸化位点和水平选择特异性高的磷酸化抗体。
样品刺激和诱导处理需要采取合理的策略。不同靶点刺激的时间和强度不同，需要查找文献或进行预实验。刺激需要做到充分但不过量。刺激过久可能会进入负反馈机制，造成检测结果下降。信号弱或无信号可能意味着诱导不充分，建议使用说明书中提到的样本或已有报道高表达的样本作为阳性对照。
用10ng/mL EGF处理Hela细胞，刺激时间分别为2、5、10、20、30、60、120分钟，检测EGFR 845位酪氨酸磷酸化。结果如下，刺激10-20分钟效果最佳，超过30分钟基本检测不到条带。
组织或细胞裂解时会释放大量的内源性蛋白磷酸酶，因此裂解液中一定要添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。裂解液需现用现配。如果检测的磷酸化位点是酪氨酸，还需要额外加1 μM的正矾酸钠。
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02 抗体选择——特异性是王道
先来一段“绕口令”。
通常情况下，非磷酸化抗体可以识别非磷酸化蛋白，也可以识别磷酸化蛋白；而磷酸化抗体只能识别磷酸化蛋白，无法识别非磷酸化蛋白；当然，一些非磷酸化抗体也可能只识别非磷酸化蛋白，而无法识别磷酸化蛋白。
选择特异性高的抗体是检测磷酸化蛋白的关键。选择磷酸化抗体时，需要查阅相关文献，确定可能发生磷酸化的位点，选择识别特异位点的抗体。同时要仔细阅读磷酸化抗体的说明书，不同抗体生产商可能推荐不同的操作步骤。
以Phospho-EGFR (Tyr1068) 抗体（货号：110463-R0027）为例，WB检测结果显示，用10 ng/mL的EGF（货号：10605-HNAE）处理血清饥饿的Hela细胞提取物30分钟，磷酸化EGFR抗体条带清晰显示，而未经EGF处理的细胞无磷酸化抗体条带。
磷酸化抗体灵敏度同样需要考虑。磷酸化蛋白表达丰度低，造成样品蛋白浓度偏低，因此高灵敏度的抗体更能保证WB检测结果有清晰的条带。
不同稀释倍数Phospho-EGFR（Tyr1068）抗体（货号：110463-R0027）的WB检测结果。样品为10ng/mL EGF处理的30分钟的血清饥饿Hela细胞，抗体稀释倍数为1:2000、1:20000、1:200000。（图片来自义翘神州）
03 内参——磷酸化WB的“双保险”
磷酸化蛋白检测通常设置两个内参，以更准确的评估磷酸化水平。
磷酸化蛋白对应的总蛋白：比如你要检测HER2磷酸化，需要跑一个HER2总蛋白。只有总蛋白与磷酸化蛋白的比值发生变化，才能说明磷酸化水平发生变化，并且排除非磷酸化因素影响，比如转录水平、蛋白质合成与降解等，更准确的判断磷酸化修饰在特定生理过程中的作用。
普通内参抗体：在Western Blot实验中，常用的内参抗体有GAPDH、beta-actin和beta-tubulin等。常规内参抗体用作体系的对照，对样品间的蛋白上样量、转膜效率等实验因素进行标准化，避免因实验操作误差导致的结果偏差，可以作为实验质量控制的指标。更多详细内容，可以查看“内参抗体怎么选才不踩坑？这份攻略指南请收藏”。
以Phospho-HER2 (Tyr1221, 1222) 抗体（货号：111140-R0023）为例，WB检测结果显示，用200 ng/mL的EGF（货号：10605-HNAE）处理血清饥饿的Hela细胞提取物10分钟，磷酸化HER2蛋白条带清晰显示，而未经EGF处理的细胞无磷酸化条带。
04 实验操作——细节决定灵敏度
1）封闭液的“致命选择”
磷酸化WB推荐5% BSA封闭。脱脂奶粉中有酪氨酸，有可能会结合磷酸化抗体而产生高背景。封闭时间不宜过长，1小时足矣。过久封闭会掩盖抗原表位，导致信号丢失。
2）转膜操作的核心要点
磷酸化蛋白推荐湿转，恒流250mA，90分钟，确保蛋白完全转移。优先选择PVDF膜，用甲醇激活10秒，增强蛋白结合。按照滤纸-胶-膜-滤纸依次组装“三明治”，避免气泡残留。
3）抗体孵育的“温度魔法”
WB急不得，磷酸化检测更是急不得，4℃抗体孵育过夜（12-16小时）不仅有充足的结合时间，而且低温环境下蛋白在膜上稳定不易脱落。二抗室温孵育1小时，摇床低速（60 rpm），防止背景弥散。
4）洗脱小技巧
建议减少洗涤次数和降低摇床转速，PBST洗涤3次，每次5分钟，摇床速度逐步提高（80→120rpm）。有一些背景信号总比完全无信号的“白板”要好。
05 结果分析——从失败中寻找突破
常见翻车现场及解决方案
为减少非特异性条带，用不含磷酸盐的缓冲液TBST代替PBS。如果在中间操作过程中使用PBS，需要在加入蛋白检测底物前，用大量TBST清洗膜，以除去过量的磷酸钠。
通过IP-WB联用、荧光WB等进阶实验，实现磷酸化信号放大。使用抗体对蛋白进行免疫沉淀获得浓缩的蛋白，实现弱磷酸化低丰度蛋白的富集，提高样品中蛋白含量。荧光蛋白印迹法，尤其是双色检测方法，可以同时孵育磷酸化蛋白（Cy3标记）和总蛋白（Cy5标记）抗体，检测结果更准确。
磷酸化蛋白的WB进阶之路在于“细节控”——样品质量、抗体特异性、操作严谨，并要时刻牢记：“低温是磷酸化的朋友，高温是它的敌人”。通过预实验优化条件，遇到问题时优先核查样品处理与封闭步骤。掌握这些避坑指南，让你轻松搞定磷酸化蛋白检测。