「WB急救室」解决电泳实验难题！10%、12%、15%凝胶浓度对应分子量对照表

分离胶和浓缩胶的成分基本相同，配方主要包括：

1）30%或40%的丙烯酰胺：由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N, N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）按一定比例混合而成。两种单体和溶液都是中枢神经毒物，在称量和溶解时应佩戴口罩，小心操作。丙烯酰胺母液见光降解，过滤后用磨口棕色瓶在4℃保存。

2）Tris-HCl缓冲液：维持凝胶的正常pH值。pH值不对会造成电泳条带诡异。需要注意的是，分离胶和浓缩胶缓冲液的pH值不同，分别为8.8和6.8。

3）10% SDS（十二烷基磺酸钠）：阴离子去污剂，可断开蛋白质的氢键和疏水键，并按一定比例与蛋白质分子结合形成复合物，使蛋白带负电荷，掩盖蛋白分子间的天然电荷差异。

4）10% APS：凝胶聚合的引发剂。室温下不稳定，需要现用现配。APS具有强氧化和腐蚀性。

5）TEMED：反应催化剂，催化APS产生自由基，加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合。需4℃遮光保存，有臭味和腐蚀性，具强神经毒性。

为了方便凝胶配制，凝胶各组分常配制成母液，在4℃保存。以下表格是凝胶常用母液配制方法。

1）清洗玻璃板、梳子

先用自来水浸泡5分钟，可用尖锐的工具轻刮厚玻璃板两侧残留的凝胶。然后用洗洁精清洗，自来水冲洗干净泡沫后再用纯水冲洗。37℃烘干或用吹风机吹干。勿用热风长时间近距离吹，防止两侧边条老化或脱落。

2）检查凝胶储存液

注意试剂有效期，观察是否澄清透明、是否有沉淀或晶体析出，如SDS在4℃容易析出结晶。APS一般配好后进行分装，保存在-20℃。TEMED应密闭避光保存于4℃

3）制备分离胶

按照上文的配方表依次加入相应体积的试剂。不同厚度的玻璃板需要胶的体积不同，一般1.0mm需配制5.0mL，1.5mm配制7.5mL。加入APS和TEMED快速手摇或振荡器混匀，立即灌胶。避免出现气泡。

注意观察分离胶的高度，预留足够空间给浓缩胶。一般浓缩胶高度为梳子下缘再往下1厘米左右。

建议用95%或无水乙醇压胶，用移液枪缓慢注入，边加边移动枪头，防止在同一位置冲出凹陷。

室温静置20-30min，稍微倾斜观察分离胶是否完全凝固。

4）制备浓缩胶及插梳子

分离胶完全凝固后倒掉酒精，并用吸水纸吸干残余酒精，注意纸不用碰到胶面。

按上文配方表配制浓缩胶，混匀后迅速灌胶。然后快速插入梳子。室温静置20-30min。

5）凝胶暂存

确认浓缩胶完全凝固后小心取下玻璃板，用保鲜膜包裹，然后浸泡于纯水或电泳缓冲液中，置于4℃冰箱保存。每块玻璃板分开包，建议在一周内使用。