「WB急救室」内参抗体怎么选才不踩坑？这份攻略指南请收藏

内参蛋白种类较多，定位或表达于多种亚细胞结构，如胞浆、胞膜、核膜、核内、线粒体内以及全血、血清、血浆等。如果不知道选择哪种内参抗体，简单高效的方法是查看相关的文献，看别人用什么内参，顺便学学研发思路。现在，我们汇总了一个图表供大家参考。

接下来，我们详细介绍5种内参抗体，能够满足90%以上的WB实验。

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）

GAPDH是参与糖酵解代谢的关键酶之一，负责催化3-磷酸甘油醛氧化为1,3-二磷酸甘油酸，检测的条带通常为36kDa上下。GAPDH几乎在所有组织中高水平表达，在同种细胞/组织中表达恒定，且很少受外部诱导因素影响。但在缺氧、糖尿病等特殊生理或病理条件下，GAPDH的表达可能会发生变化，此类情况下不适合作内参。

Actin（肌动蛋白）

β-Actin是一种重要的高度保守的细胞骨架蛋白，条带大小通常在43kDa左右。Actin和Tubulin一起构成细胞骨架的主要部分，负责维持细胞形态、运动、生长和增殖。在一些特殊组织中（如脂肪组织），β-Actin的表达量可能会发生变化，需要谨慎选择。Actin几乎在所有真核细胞中稳定表达，因此适用于全细胞和细胞质样品的WB实验。

Tubulin（微管蛋白）

Tubulin在维持细胞形态和分裂过程中具有重要作用，条带大小在55kDa左右。Tubulin有α、β、γ等多个亚基，其中α-Tubulin和β-Tubulin约占微管蛋白总量的80-95%，具有相似的三维结构。微管蛋白表达水平可能受到细胞状态影响，如细胞周期、应激等。在抗生素和抗有丝分裂耐药研究中，发现Tubulin表达存在差异，因此耐药性研究中内参蛋白不建议使用Tubulin。由于神经细胞的轴突和树突需要Tubulin维持结构，因此脑组织中Tubulin表达会高一些。

Histone H3（组蛋白）

Histone H3是构成染色质的基本成分，理论分子量约为17kDa，定位在细胞核。Histone H3在多种组织和细胞中均有表达，主要在细胞分裂的S期。表达量会随着细胞分离减慢而急剧下降。组蛋白是已知蛋白质中最保守的，如小牛胸腺H3序列仅与海胆相差1个氨基酸，而与豌豆的H3也只有4个氨基酸不同。

PCNA（增殖细胞核抗原）

PCNA在细胞核内合成并存在于细胞核内，是反应细胞增殖状态良好的指标，分子量为36kDa。PCNA广泛存在于真核细胞，并在多种肿瘤细胞中高度表达。PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白，与细胞增殖、DNA合成相关，通过翻译后修饰在DNA损伤耐受机制中发挥重要作用。

03 掌控规则：快速准确选择内参

WB实验内参选择遵循“黄金三角”原则：

（1）样本种属来源

哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择GAPDH、β-actin、β-tubulin、Lamin B1、Histone H3等。植物或其它稀有物种的样本，需要参考文献或选择高度保守的管家基因作为内参。

（2）分子量错开5kDa以上

即目的蛋白分子量与内参蛋白分子量相差要在5kDa以上，避免信号干扰和增加抗体孵育与图像分析难度，确保两种蛋白质在检测过程中不出现重叠。但是两种大小相差太多也不好，可能会增加转膜时间，造成蛋白样品降解损失。比如目的蛋白分子量为45kDa，就不能选择β-Actin作为内参了，可选择GAPDH或β-tubulin，不建议使用Vinculin。

（3）亚细胞定位精准匹配

根据目的蛋白的表达部位选择相应的内参。如上文内参图鉴所示，不同的内参适用于不同的亚细胞研究。对于细胞质或全细胞蛋白质检测，一般选择GAPDH、β-actin或β-tubulin。如需检测亚细胞器蛋白，则要选择对应的内参。比如常用的细胞核内参有Lamin A、Lamin B、TBP、PCNA、Histone-H3，线粒体内参有VDAC1和COXIV。

除了以上的“黄金三原则”还应明确实验条件和内参表达丰度，比如：

✔ 检测磷酸化蛋白时，要选择结构蛋白作内参，如β-Actin和β-Tubulin；

✔ 组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH表达升高，衰老的骨骼肌中GAPDH表达会下降，此类情况GAPDH均不适合作内参；

✔ 细胞凋亡实验不应选择Lamin作为内参；

✔ 某些抗癌或抗真菌药物会影响Tubulin的表达；

✔ PCNA主要在细胞分裂S期表达，不推荐用于非增殖细胞研究；

✔ 检测多组织多细胞样本的对比表达量时，建议选用GAPDH。GAPDH属于代谢类蛋白，在活组织中表达恒定。而β-Actin和β-Tubulin属于结构蛋白，在不同组织中表达会有差异。