「WB急救室」轻松搞定封闭液：6种类型大比武，助你WB实验封闭液选择不再愁！

01 WB：没有小角色，但有封闭液

在Western Blot（WB）实验中，封闭液看似只是辅助试剂，实则扮演至关重要的角色。

封闭液中的蛋白或其他分子以物理封闭（填充疏水空隙）或吸附覆盖的方式，与膜表面的空白位置结合。抗体孵育时，只会与特异性靶蛋白结合，不会被非特异性吸附。因此，封闭非特异性结合位点，能够提高检测的特异性。

封闭液可以阻止某些抗原表位被非特异性结合的物质所掩盖，增强抗原与抗体的结合力。封闭的过程有助于消除实验中的干扰因素，降低背景信号。同时，封闭液还能起到稳定膜的作用，防止膜在抗体孵育过程中干燥或损坏。

理想的封闭液应封闭所有未结合位点，而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂存在交叉反应。

02 封闭液选择的四大考量因素

封闭液的选择，需要从靶蛋白特性、抗体特性、检测灵敏度及成本时效等维度进行考虑。比如高浓度的封闭液在降低背景的同时也会降低信号，因此低丰度蛋白最好使用低浓度的封闭液。如果抗体对BSA有交叉反应，选择脱脂奶粉可能更合适。如果实验要求背景信号极低，建议选择使用高纯度的BSA或鱼明胶。成本方面，脱脂奶粉较为经济。

03 6种封闭液“大比武”

1. 脱脂奶粉

配方：通常使用5%的脱脂奶粉，称取5g脱脂奶粉，溶于TBS或PBS，添加0.1% Tween-20（TBST或PBST）。

脱脂奶粉经济实惠，封闭效果全面，常用于多种普通蛋白的WB实验，但不适用于低丰度蛋白、磷酸化蛋白和生物素检测。

注意事项：脱脂奶粉是多种蛋白的混合物，成分复杂。奶粉中含有磷酸化的酪蛋白，可被抗磷酸化酪氨酸的抗体识别，所以检测磷酸化蛋白时，不建议使用脱脂奶粉。同样，脱脂奶粉中含有生物素（Biotin），不能用于生物素检测体系。脱脂奶粉可能会掩盖低丰度蛋白，导致条带微弱，因此在封闭时可将其浓度降至1%或用BSA代替。

2. 牛血清白蛋白（BSA）

配方：通常浓度为2%-5%（m/v），称取2-5g BSA粉末，溶于100ml 1xTBST。

BSA是从牛血清中分离提取的一种球蛋白，成分单一，不易产生非特异性结合，背景噪音小。BSA封闭效果较好，适用于磷酸化蛋白检测。

注意事项：通常推荐每cm2膜使用0.1-0.2ml封闭液，如一张6*8cm的膜需要5-10ml封闭液，因此WB实验中封闭液用量会较大，使用BSA会增加成本。BSA可能含有污染性IgG或血清蛋白，建议在使用前进行过滤。BSA含有磷酸酪氨酸，会与抗磷酸酪氨酸抗体发生交叉反应。

3. 酪蛋白

配方：推荐浓度为1%-5%（m/v），称取1-5g 酪蛋白，溶于100ml 1xTBST。

酪蛋白是从牛奶中提取的蛋白质，与膜表面的正电荷区域高效结合，降低背景噪音。对疏水性膜（如PVDF）的封闭效果优于BSA，适用于高灵敏检测体系。酪蛋白在中性或碱性条件下带负电荷，与带负电的胶体金排斥，因此可用于胶体金标记系统。酪蛋白交叉反应低，适合多抗检测。

注意事项：酪蛋白属于磷酸化蛋白，不能用于磷酸化WB实验。如果靶蛋白是磷蛋白，需用BSA或无蛋白封闭液。酪蛋白难溶解，需要预先加热或调节pH才能完全溶解，且溶解后为半透明，容易被人误解为污染后的浑浊。酪蛋白不适用于生物素-链霉亲和素检测系统，如Streptactin-HRP实验。

4. 鱼皮明胶

配方：通常使用0.5%-1%（m/v），溶于1xTBST中。

鱼皮明胶也称为鱼胶，由冷水鱼皮提取的胶原蛋白水解小分子多肽，与膜结合效果更好，封闭效率高，可在15分钟左右快速完成封闭。与BSA和脱脂奶粉相比，鱼胶不会与哺乳动物来源的抗体发生交叉反应，有效降低背噪。

注意事项：鱼皮明胶生产工艺复杂，多为进口，目前很少用于WB封闭。且含有内源性生物素，不能用于Biotin检测系统。

5. 血清

配方：5%-10%（v/v）

血清也能用来当封闭液，但与脱脂奶粉、BSA相比，没有明显的优势，所以几乎没人用。血清含有免疫球蛋白和血清蛋白，会与抗体产生交叉反应，增加非特异性条带。血清可以封闭样品中的内源性Fc片段结合位点，阻断抗体与样品中的Fc受体结合，减少假阳性。

6. 无蛋白封闭液

Polyvinylpyrrolidone，PVP属于水溶性多聚物，可快速与NC、PVDF膜结合，是传统封闭液的非蛋白替代品。PVP使用浓度为0.5-2%（w/v），常和其他封闭液一起使用，在检测小分子蛋白时有效。

吐温-20（Tween-20）属于非离子型去污剂，具有很强的非特异性吸附洗脱作用，同时降低蛋白间的疏水作用，提高特异性抗体识别能力，常与脱脂奶粉、BSA等配合使用。

商品化的快速封闭液通常含有提纯的蛋白或不含蛋白，封闭时间短。不含哺乳动物来源的蛋白成分，避免与抗体发生交叉反应，适用于磷酸化检测和NC、PVDF膜。

04 “封印”小技巧

1. 转膜结束前30分钟配置封闭液，并用涡旋仪、摇床等使封闭液充分溶解、混匀，确保没有不溶物颗粒，可用过滤或离心的方法去除未溶解的颗粒。

2. 将膜放入封闭液中，4℃下轻轻摇动孵育1-2小时，或室温下孵育1小时以上。封闭时间过长过短都会影响封闭效果，可根据实际情况慢慢优化。

3. 缓冲液可用TBS或PBS，如果下游底物有碱性磷酸酶则需使用TBS。在缓冲液中加入0.05-0.1%的Tween-20，能增强封闭效果，所以封闭剂溶解推荐使用TBST缓冲液。

4. 含有Tween-20去污剂的溶液会促进细菌生长，因此TBST需要在使用前新鲜配制。

5. 封闭后，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5分钟，以去除多余的封闭试剂。

封闭有哪些常见的问题？

1. 膜上有黑色斑点

可能的原因：奶粉未完全溶解

解决方法：用涡旋仪、摇床等使封闭液充分溶解、混匀，用过滤或离心的方法去除未溶解的颗粒。

2. 背景高

可能的原因：封闭时间短

解决方法：一般封闭时间为4℃下轻轻摇动孵育1-2小时，或室温下孵育1小时以上，如果背景深可以增加封闭时间。也可以提高封闭液的浓度，比如将脱脂奶粉从5%提高到8%，BSA从3%提到5%。

3.条带信号弱

可能的原因：封闭过度

解决方法：适当降低封闭液浓度，或更换封闭液。当然，封闭过度很少见，条带信号弱可能需要优先考虑其他因素，比如样品上样量、浓度、一抗二抗浓度等。