「WB急救室」抗体孵育全攻略：室温vs 4℃，你知道这些避坑小技巧吗？

01 抗体孵育：温度与时间的博弈

抗原抗体反应的最适温度一般为37℃，但在实际实验过程中，我们常常采用4℃或室温。那么，在抗体孵育过程中，到底哪种温度才是最优呢？

温度对抗原抗体反应的影响体现在分子运动速度和碰撞频率方面。在15-40℃范围内，随着温度的升高，分子热运动加剧，碰撞频率增加，抗体更容易找到抗原，加快反应速率。反之，低温降低分子运动和碰撞频率。

然而，在较高温度下，反应时间短，可能导致抗原抗体复合物结合较疏松，容易再解离。在低温条件下，反应速率虽慢，但所形成的复合物结构更稳定。

较高温度还会增加抗体与非目标分子的碰撞机会，导致非特异性结合增加，干扰实验结果。低温可增强抗原与抗体之间的相互作用力，增强抗体亲和力，有利于检测弱阳性样本。因此，较低温度（如4℃）能够减少非特异性结合，提高信噪比，以及提高实验的特异性和灵敏度。

抗体不同孵育温度和时间比较：

02 实战指南：抗体孵育方案与技巧

抗体孵育的一般操作步骤：

封闭：将蛋白转移后的膜置于摇床，用5%脱脂牛奶或BSA室温封闭1h。

一抗孵育：封闭后的膜用TBST清洗2-3次。根据抗体说明书要求配置一抗工作液，一抗和膜置于摇床，室温孵育2h，或4°C孵育过夜。一抗孵育结束后，用TBST洗涤膜2-3次，每次5-10分钟。

二抗孵育：根据抗体说明书的要求配置二抗工作液。二抗和膜置于摇床，室温孵育1h。二抗孵育结束后，用TBST洗涤2-3次，每次5-10分钟。根据二抗的显色信号，配置显影液，将显影液浸润膜，放入凝胶成像仪中成像。

抗体孵育Tips

1）孵育前做好准备工作：查阅相关文献，熟读抗体说明书，查看抗体稀释倍数。如果没有建议的稀释倍数，可参照1:100-1:5000的稀释倍数进行预实验来确定。一抗浓度过高容易产生高背景和非特异性条带。

2）确保一抗已正确解冻，按照说明书推荐的稀释倍数，用封闭液或不含封闭液的1x TBST稀释一抗。

3）一抗孵育时，将膜根据大小裁开，放入抗体孵育盒内。一抗量至少要完全覆盖膜，常使用的抗体孵育盒最少用量为3mL。

4）膜上要做好标记，分清楚正反面和上下，剪一个小角最方便。

5）将抗体孵育盒置于摇床上缓慢摇动，一般转速在50-100转/分钟。

6）注意在整个孵育过程中，应使膜保持平整，保持避光、低温条件，以维持抗体活性。

7）一抗孵育结束后，通过洗膜去除未结合的抗体，否则会导致高背景。常用洗液为PBST或TBST，后者效果较好。清洗次数和时间根据具体实验来确定，建议清洗3-5次，每次5min，每次均于室温平缓摇动。

8）二抗需要与一抗宿主的物种相对应，且识别类型和亚型与一抗一致。如使用兔源一抗，则需要使用抗兔二抗，一抗类型是IgG，二抗则选择抗IgG。

9）二抗通常带有不同的标记物，如HRP、AP。推荐使用HRP标记二抗，灵敏度比AP标记二抗高。

10）二抗孵育同样在摇床上温和摇动。孵育时间一般为2h，具体时间可根据厂商推荐和实验经验调整。

11）二抗孵育结束后同样用TBST清洗3-5次，以去除未结合的二抗，确保信号的特异性。

12）显影液和定影液最好用新鲜配制的，且均有毒性，操作时做好防护，在棕色瓶内避光低温保存。

03 抗体孵育：常见问题诊断与解决方案

1）根据抗体说明书或官网信息，确认此抗体是否适合用于WB实验及其免疫原信息。

2）按说明书推荐浓度设置梯度稀释预实验，确定抗体合适的稀释倍数。

3）一抗4℃过夜孵育比常温孵育效果好。4℃孵育时间至少要超过9h。有些抗体反应“迟钝”的可能需要更长的孵育时间，如延长至2天。

4）按照抗体说明书，选择合适的稀释液和保存温度。抗体要避免反复冻融，一般保存于冰箱温度变化较小的区域，如冰箱后壁处，避免放置于冰箱门处。

二抗要与一抗的宿主种属、亚型相匹配，以及二抗的分子形式、偶联探针满足WB实验要求。

1）建议优先选择特异性好的抗体，如兔单抗。

2）适当提高一抗稀释倍数。

3）提高封闭液的浓度，如脱脂奶粉从5%提高到10%，或用BSA替换脱脂奶粉。

4）增加洗剂次数与时间，如提高到5-8次，每次8-10min

04 抗体孵育进阶技巧：抗体选择

在WB实验中，会用到两种抗体：用于识别目的蛋白的一抗，以及识别一抗的二抗，目的是提高检测灵敏度。

二抗种类较少，一般根据一抗的宿主种属、亚型进行选择。如一抗宿主是小鼠，则选择抗小鼠的二抗。这里的种属是指抗体来源宿主的种属，即Host或Source的种属，而非反应种属（Species reactivity）。

二抗上的偶联探针主要有酶（HRP、AR等）、荧光基团（FITC、TR、PE）和生物素（Biotin）。IHC、WB和ELISA常选用酶标二抗，免疫荧光和流式细胞术常选用荧光基团的二抗。

一抗选择是WB的关键。

1）明确需求，目的蛋白信息很重要。

通过UniProt数据库查询蛋白序列，确认抗体的表位区域。磷酸化抗体需注意修饰位点（如Phospho-AKT (Ser473)）。

2）确认抗体的物种反应性

以实验样本的种属为准，Human、Mouse或Rat，结合一抗说明书，选择种属经过验证的抗体。

3）确认抗体能用于WB检测

WB专属应用验证可确保实验结果。查看抗体商家提供的WB验证结果，确定条带清晰且有特异性。同时也可以选择多应用验证抗体，性价比更高，可以满足多种类型实验需求。

4）确认抗体宿主种属

一抗宿主种属选择较为重要，尽可能选择与样本不同种属的一抗，从而避免二抗与样本中的内源性免疫球蛋白产生交叉反应。如检测小鼠脑组织样本蛋白的表达，一抗最好选用兔源，二抗则可选择抗兔IgG。

5）单抗还是多抗

根据抗体识别的抗原表位将抗体分为单克隆抗体和多克隆抗体。单抗只能识别抗原上的单个表位，而多抗识别多个表位。因此单抗特异性强，批间差异小，WB条带单一，而多抗特异性较差，WB条带可能为多个。建议人、小鼠等常见物种选择单抗，未经验证的小众物种选择多抗可以提高实验成功率。