「WB急救室」核蛋白实验总是出问题？这些细节你注意到了吗？

灵魂之问：核蛋白or总蛋白？

核蛋白是定位在细胞核内的蛋白质，包括组蛋白、转录因子、DNA修复酶等。核蛋白在调控基因表达、细胞周期等生理过程中发挥重要作用。与细胞质蛋白不同，核蛋白通常与DNA结合紧密，在细胞裂解过程中容易被其他细胞器或碎片污染。

因此，我们常常会面临一个问题：WB检测核蛋白时需要提取核蛋白吗？用总蛋白能做出来吗？这里主要需要考量两点：

1）核蛋白表达水平：通过UniProt、BIOGPS、GEPIA、The Human Protein Atlas等数据库查询蛋白质的表达信息。

以UniProt数据库为例，查询p53蛋白的表达情况，结果显示其在组织中普通存在，在细胞质、细胞核、内质网、线粒体等亚细胞中均有表达，因此可直接提取总蛋白用于WB检测。

源自UniProt数据库

2）实验目的

如果为了检测核蛋白是否存在或同一蛋白在不同样本中的含量，即定性或半定量WB检测，可根据核蛋白的表达水平选择。一般蛋白表达水平高的选择提取总蛋白，蛋白表达丰度低的选择提取核蛋白。

如果是要分析核蛋白合成后运送到不同亚单位情况或表达差异，不管蛋白表达情况如何，都需要提取核蛋白进行检测。

核蛋白提取注意事项

一般核蛋白是在浆蛋白的基础上提取的，以下操作步骤和裂解液配方可供参考。

细胞中浆蛋白的提取

1，收集细胞，3000rpm，4℃离心5min，弃上清。

2，加入1ml预冷的PBS，将细胞重悬，将细胞悬浮液移至2ml EP管中。

3，3000rpm，4℃离心5min，弃上清。

4，按照每107个细胞添加1 ml的比例，添加预冷Buffer A，重悬。4℃放置10min，离心（3000rpm，4℃离心3min）。

5，弃上清，按照1.5×107个细胞加入500µl Buffer B，重悬。4℃放置3min，离心（5000rpm，4℃离心5min）。

6，吸取上清。上清为浆蛋白。

细胞中核蛋白的提取

7，在沉淀中加入Buffer C，按照1.5×107个细胞加入500µl Buffer C，重悬。4℃放置3min，5000rpm离心1min，弃上清，12000rpm离心30sec，完全吸净上清。

8，沉淀中加入50 µl Buffer D，重悬。超声处理（1.2"×5）。4℃放置30min，每隔10min振荡一次。

9，12000rpm，4℃离心10min，取上清，即为核蛋白。

Buffer A的配制：

Buffer B的配制（2 ml）：

Buffer C的配制：

Buffer D的配制（2 ml）：

内参选择是关键

核蛋白WB检测的内参选择并非固定，需要根据实验样品和实验目的来确定。

1）使用总蛋白作为样品，检测核蛋白表达情况，可以选择管家基因作为内参，如Actin、Tubulin、GAPDH。内参的目的是校正蛋白上样过程中的误差，保证实验结果准确，以及检测蛋白转膜是否完全，整个WB显色发光体系是否正常。

2）使用分离出的细胞核组分作为样品，检测核蛋白表达、定位或与其他组分检表达差异时，需要选择特异的细胞核内参，如Lamin A/C、Lamin B、核孔蛋白，建议同时添加管家基因作“双内参”。验证样品是核蛋白的同时，排除其他组分的干扰。