「WB急救室」膜蛋白煮样=灾难现场？室温/37℃/50℃/70℃/95℃，你选择哪个温度？

01 膜蛋白样品为何不能高温煮样？

对于大部分胞质蛋白来说，煮样是常规操作。但对于膜蛋白，可能就比较复杂。膜蛋白具有独特的三维结构，高温煮样可能会导致其疏水区暴露，发生聚集，形成二聚体或多聚体，导致蛋白分子量变大，造成无法检测到条带或检出的条带位置不对。

以跨膜铁转运蛋白SLC40A1为例，发现煮沸会造成蛋白聚集或断裂。

SLC40A1（也称为Ferroportin 1、FPN1）是一种63kDa大小的跨膜铁转运蛋白，在铁代谢和细胞铁稳态中发挥关键作用。Yoshiaki Tsuji对煮沸和室温处理SLC40A1蛋白的WB结果进行了分析。结果发现，样品经过95℃煮沸5分钟会在顶部或其它位置出现多条非特异性条带，说明蛋白发生聚集或断裂。而室温处理的样品非特异性条带明显减少，尤其是顶部无大分子量条带，并且在63kDa处检测到SLC40A1蛋白。

图片源自文献：doi: 10.1371/journal.pone.0235563

膜蛋白样品的正确打开方式

如上，膜蛋白不能直接煮样，我们推荐在37℃下放置10-30分钟，以减小蛋白聚集的风险。我们也可以根据膜蛋白的具体属性进行预实验，以确定最佳的样品处理条件。

具体步骤如下：

1）将提取的蛋白样品分成等量的几份。

2）向每份样品中加loading buffer。

3）分别将样品置于室温、37℃、50℃、70℃下处理15-30分钟。如果样品充足，可以取一份在95℃处理5-10分钟作为对照。

4）将处理后的样品上样到同一块PAGE进行电泳。

5）完成转膜、封闭后，选择合适的抗体进行孵育。

6）比较不同温度处理后条带的清晰度和位置，确定最佳变性温度。

膜蛋白样品处理还有哪些坑要避开？

膜蛋白与细胞膜结合紧密，尤其是跨膜蛋白，具有多重跨膜结构域，提取分离困难。膜蛋白在总蛋白中占比较低。部分膜蛋白分子量较大。因此常常导致膜蛋白WB检测失败。

基于这些因素，我们需要“温柔”对待膜蛋白样品：

1）确定膜蛋白的特性：实验开启前，我们要充分了解目标膜蛋白在哪些组织表达，跨膜次数和分子量大小，以及在细胞中的分布和表达情况。对于表达量高且不跨膜的蛋白，可以提取总蛋白进行检测，低丰度蛋白需要预先富集膜蛋白。跨膜蛋白次数越多，提取难度就越大，需要预先富集蛋白再检测。

2）避免膜蛋白断裂：在裂解液中加入0.1-1% Triton X-100或NP-40，同时添加5%甘油或0.1% BSA的蛋白稳定剂，可有效溶解细胞膜，减少对膜蛋白的破坏。同样，裂解液维持在pH7.4左右，适当的盐浓度（如150 mM的NaCl），添加新鲜的PMSF蛋白酶抑制剂，能够防止蛋白降解。

3）快和冷是精髓：膜蛋白提取同样需要全程在冰上操作，所有试剂、耗材提前4℃预冷，离心机调至4℃预冷。建议超声处理样品，对于细胞样品可以在35-40%功率下进行3次超声破碎，每次1-2秒，每次间隔5-10秒，整个过程冰浴操作。对于组织样品的研磨，需要用液氮预冷研钵。