「WB急救室」煮样不离心=实验白做？WB煮样过程的5个致命细节，你中了几个？

细节一：上样缓冲液是否“缺斤短两”？

尽管上样缓冲液存在浓度差异，但组成基本一致，包括Tris缓存体系、SDS、还原剂（DTT或2-ME）、甘油、溴酚蓝这5类。在使用前要确认溶液澄清，无污染。更重要的是要确认是否添加还原剂，因为DTT易被氧化，2-ME易挥发，二者都不稳定，最好现用现加。

细节二：煮样是否达标？

常规煮沸处理：加入上样缓冲液后，可以用移液器轻轻吹吸几次或者涡旋振荡3-5s，充分混匀样品和缓冲液，保证受热均匀。然后放入沸水浴或PCR仪中，95-100℃煮沸5-10分钟。

煮沸后的样品迅速以12000rpm高速离心3-5分钟，以去除可能形成的沉淀，避免在电泳过程中造成拖尾现象。

离心后样品置于冰上，准备上样电泳。

煮样时间可根据蛋白浓度、分子大小、上样缓冲液比例等因素进行调整。如蛋白浓度高，可适当增加煮样时间，但最好不超过10 min。如果10 min后仍然吸不出样品，看增加上样缓冲液稀释或对样品进行超声，再次煮样5-10 min看看效果。若煮样时间过长，样品出现明显的蛋白沉淀和水分层，建议丢弃吧。大分子蛋白（如IgM 220 kD）可适当延长时间。

煮样要“一日三省”：煮样前是否混匀？煮样过程中温度是否维持在95-100℃？煮沸后的样品是否离心？

细节三：煮样后样品该如何保存？

煮样后的蛋白样品应尽快使用，如果需要保存，可根据时间长短选择保存温度。一般短期保存（数天）可放置于4℃冰箱。如果长期保存，应将样品置于-20℃，或分装后置于-80℃保存，避免反复冻融，通常可以保存一年以上，但建议3个月内使用。

长时间保存可能会发生内源性剪切，造成部分蛋白降解，因此在保存时可以加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。此外，添加10-50%的甘油作为保护剂，防止冰晶对蛋白质的损伤。

保存半年以上的样品再次使用前需要补加适量的还原剂（终浓度1%），并重新煮样后再使用。

细节四：哪些情况需要再次煮样？

煮沸的目的是通过高温使蛋白质变性，破坏其三维结构，变成线性多肽链。冷冻保存并不会导致蛋白质结构恢复原状。因此彻底变性的蛋白在短期内重新电泳上样，无需再次煮沸。当出现以下情况时，建议重新煮样：

（1）样品中出现颗粒物质或聚集物；

（2）反复冻融可能导致部分降解或形成肉眼不易察觉的微小聚集体；

（3）长期储存，如3个月以上，样品变得浑浊或出现沉淀；

（4）如果使用预制胶或保存时间较长的电泳胶，建议再次煮样以确保实验效果。预制胶对蛋白浓度和上样量较为敏感，样品不应过于粘稠，否则可能会导致电泳条带出现拖尾、弥散等现象。

细节五：哪些蛋白不能煮样？

在WB实验中，煮沸样品可能导致部分蛋白变性聚集或抗原表位破坏，影响检测结果。以下4类蛋白需谨慎处理，建议避免高温煮沸：

（1）膜蛋白：膜蛋白的疏水跨膜结构域在高温下易形成不可逆聚集，形成二聚体或多聚体，使蛋白质分子量发生变化，导致检测出的条带位置不对。且可能遮蔽抗体识别表位，导致蛋白无法被抗体识别，结果无信号。聚集的蛋白还容易堵塞加样孔，电泳时滞留在胶孔或转膜失败。

替代方案：通过预实验确定膜蛋白的处理条件，比如设置温度梯度，在50-70℃加热10-15分钟，或者添加强效去污剂辅助溶解，如1% LDS、0.5% Triton X-114。

（2）多聚体或复合体蛋白：如转录因子复合体、病毒核衣壳蛋白等，亚基间存在非共价键，高温会导致复合体解聚，出现异常条带，如多条小分子带。

替代方案：室温下，按比例混匀样品和上样缓冲液，静置30分钟。添加低浓度交联剂稳定复合体结构，如0.1% DSS（葡聚糖硫酸钠）。

（3）磷酸化蛋白：磷酸化蛋白的磷酸基团在高温条件下会被破坏，发生去磷酸化，导致抗体无法识别抗原表位。高温还会破坏磷酸酶抑制剂的活性，加速去磷酸化。

替代方案：温和变性，加入上样缓冲液后37℃处理20-30分钟。在变性之前，一定要加磷酸酶抑制剂，如10mM NaF+1mM Na3VO4（正矾酸钠）。

（4）热敏感蛋白：有些蛋白对温度较为敏感，如线粒体蛋白、溶酶体蛋白或者热休克蛋白等，高温可能导致蛋白聚集或者降解，此类蛋白不适合煮样。

替代方案：37℃放置10-30min，使用低温去污剂，如1% LDS