「WB急救室」蛋白煮样不盲从，3连问洞悉变性背后的4大关键机制

一问：煮样的目的与原理是什么？

通过高温（如95℃-100℃）和还原剂（如β-巯基乙醇或DTT）的共同作用，使蛋白质分子的氢键、疏水键、二硫键等断裂，使其二级、三级和四级结构展开为线性多肽链的一级结构。

蛋白质的高级结构可能成为WB实验中的“绊脚石”，对蛋白质的迁移率造成影响，导致条带模糊、位置异常等。煮样消除了蛋白质空间构象对电泳结果的干扰，确保蛋白质的迁移率仅与其分子量大小有关。

SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，能与变性后的蛋白质按质量比约1.4:1结合，赋予所有蛋白质相似的电荷密度。SDS与蛋白质的结合并非自发，需要一定的物理化学条件，高温是最简便快捷的。煮沸处理能够打破蛋白质内部的非共价键，确保蛋白质的完全变性和解聚。

SDS的十二烷基链可以插入蛋白质的疏水核心区域。破坏蛋白质三级和四级结构间的疏水相关作用。强还原剂β-巯基乙醇或DTT断裂半胱氨酸残基间的二硫键，进一步破坏蛋白质的四级结构。SDS还能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二级和三级结构，使蛋白质去折叠。SDS与蛋白质的疏水部分结合后，在蛋白表面形成一层负电荷（如图所示）。总之，SDS通过破坏蛋白质的疏水作用、氢键、二硫键，并形成带有大量负电荷的SDS-蛋白质复合物，使蛋白质在电泳过程中以一级线性结构进行分离。

Modified from Alberts B et al., Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York, NY: Garland Science, 2002.

煮沸处理能够淬灭蛋白样品中存在的一些蛋白酶，防止样品降解，确定蛋白质在电泳过程中保持完整。蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶类，如半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等。它们可能会随时出现在样品中，一旦被激活，就会像“剪刀”一样，将蛋白质分解成碎片，造成电泳出现多条带，使得WB结果非特异性条带增加或目的条带变弱甚至“白板”。因此需要及时灭活样品中的蛋白酶。煮沸处理是一种有效的方法，能够确保蛋白质在电泳过程中的完整性。

源自书籍：Hydrolysis in food processing and its impact on allergenicity of food

95-100℃使得蛋白质分子内部相互作用力减弱，不易发生聚集和沉淀。此外，煮沸还能够去除样品中的气泡或其它难溶杂质。每次上样前进行煮样，能够确保实验条件一致，提高WB结果的可靠性和重复性。蛋白煮样不充分可能会导致条带模糊或缺失，如果样品还存在高级结构会影响电泳迁移率，导致条带位置不准确、拖尾、弥散等。

二问：上样缓冲液中各组分的作用是什么？

如上，常用的变性剂是SDS，能够破坏维持蛋白质高级结构的作用力，包裹在蛋白质一级结构表面，使其带负电荷。除此之外还可以用LDS（十二烷基硫酸锂）。LDS去污能力与SDS相当，适合低温环境（4-25℃）。

通常1X上样缓冲液中含有2-5%（w/v）的SDS或LDS。SDS常用于Tris-甘氨酸胶体系，LDS用于Bis-Tris和Tris-乙酸胶体系。

常见的还原剂有二硫苏糖醇（DTT）和β-巯基乙醇（2-ME），用于破坏蛋白质间的二硫键，并防止半胱氨酸的氧化，与SDS协同作用，使蛋白质线性化。两者在蛋白样品制备中的还原效果相差不大。

通常1X上样缓冲液中含有1%（w/v）的还原剂。需要注意的是DTT易被氧化，2-ME易挥发，二者都不稳定，最好现用现加。

上样缓冲液常用Tris-HCl体系，pH保持在6.8左右，防止低温保存过程中蛋白质的肽键断裂，还可以抑制酶促反应，保证蛋白质的稳定。

增加样品密度，确保样品下沉到点样孔，防止样品飘散。通常1X缓冲液中浓度在5-10%（v/v）之间，小分子蛋白样品可适当调整到10-15%。

用于指示样品在凝胶中的位置。常用的示踪染料除了溴酚蓝还有考马斯亮蓝G-250、酚红等。一般终浓度为0.1%（w/v）。

三问：怎么煮样才科学？

蛋白样品在完成提取后应尽快进行煮沸处理，防止样品中可能存在的蛋白酶“作妖”，导致样品降解。

常规煮沸处理：加入上样缓冲液后，可以用移液器轻轻吹吸几次或者涡旋振荡3-5s，充分混匀样品和缓冲液，保证受热均匀。然后放入沸水浴或PCR仪中，95℃-100℃煮沸5-10分钟。煮样完成后，迅速以12000rpm高速离心3-5分钟。离心后样品置于冰上，准备上样电泳。

煮样时间可根据蛋白浓度、分子大小、上样缓冲液比例等因素进行调整。如蛋白浓度高，可适当增加煮样时间，但最好不超过10min。如果10min后仍然吸不出样品，看增加上样缓冲液稀释或对样品进行超声，再次煮样5-10min看看效果。若煮样时间过长，样品出现明显的蛋白沉淀和水分层，建议丢弃吧。大分子蛋白（如IgM 220kd）可适当延长时间。

煮样前需要按照一定比例加入loading buffer，主要与buffer浓度有关。以2X buffer为例，按1:1的体积比在样品中加入buffer，如10μL样品需加入10μL 2X buffer，制成20μL 混合液。5X buffer则需按4:1的体积比加入buffer，即10μL样品需加入2.5μL 5X buffer，制成12.5μL 混合液。

前提条件是蛋白样品的浓度是一样的。如果不一样则需要加入不同体积的buffer。如表格所示已测定4种样品的蛋白浓度。为了保证蛋白质上样量一致，如每个泳道的上样量为30μg，则每个样品的上样量分别为：3.99μL、5.74μL、4.61μL、2.48μL。