「WB急救室」杂带多、非特异条带泛滥？6个"背锅侠"竟是实验老手！

1，蛋白样品的“锅”有点大

1）需要通过BCA或Bradford法精确测定蛋白浓度，然后根据蛋白浓度选择等质量或等体积上样。WB每条泳道总蛋白的上样量通常为20-50μg，磷酸化蛋白可能需要50μg。保证蛋白质量的同时，上样体积不宜过多，一般为5-10μL。

2）细胞裂解前加入蛋白酶抑制剂，如PMSF、AEBSF、抑肽酶等。裂解过程要低温、快速，如采用冰浴超声多次短暂循环方法，打1-3秒停2-5秒，重复5-10次。

3）查阅文献和数据库，进行生物信息学分析，确定蛋白质的修饰位点信息，比如磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化等。可以对样品进行去修饰化处理验证，加入磷酸酶、糖苷酶等酶。或使用未修改的纯化蛋白、敲除目的蛋白的细胞样本作为阴性对照。用5% BSA替代脱脂奶粉封闭，可减少磷酸化或糖基化的非特异性结合。

4）针对目的蛋白存在多个亚型，可选择靶向亚型独特区域的抗体，如N端或C端可变区。使用高浓度分离胶（如15%）提高分辨率。使用Image Lab软件对多条带分别定量，结合总蛋白归一化法（如Stain-Free技术）校正表达量。

5）如果细胞传代次数过多，会造成蛋白表达模式发生分化，出现非特异性结合，建议用原代细胞和待测样品细胞一起做对照实验。

2，一抗的“锅”也要查一下

1）根据抗体说明书或官网信息，确认此抗体是否适合用于WB实验及其特异性。

2）按照抗体说明书，选择合适的稀释液和保存温度。常用的稀释液包括PBS、TBST或市售抗体专用稀释液。一般建议抗体保存在-20℃。分装是避免抗体降解和污染的有效方法，分装量不应少于10μL。具体需以抗体说明书为准，建议在使用前咨询厂商技术支持进行确认。

3）根据抗体说明书推荐浓度范围，进行浓度梯度优化实验。稀释液使用含有5%脱脂奶粉或BSA的TBST缓冲液，可减少非特异性结合。

4）建议首次使用新抗体时，平行设置4℃与37℃孵育组，对比选择最佳条件。一般建议一抗4℃过夜孵育，如果赶时间，可以室温孵育2h。高温（如37℃）会加速抗体与蛋白的分子碰撞，增加抗体与非目的蛋白结合的概率，或者造成蛋白样品、抗体发生构象变化，暴露非特异性结合位点。可根据抗体类型和目标蛋白丰度，进行不同温度不同时间段的优化实验。仅加二抗孵育可排除二抗非特异性结合。使用同种属同亚型的非靶点抗体做同型对照，验证目的蛋白的特异性。

3，封闭的“锅”也常见

在Western blot（WB）实验中，封闭是阻断膜上非特异性结合的关键环节。封闭液中含有一些非特异性蛋白质或其他分子，可与膜表面的非特异性结合位点结合，从而减少抗体与膜的非特异性结合，降低背景信号。常用5% 脱脂奶粉或3% BSA室温封闭1小时或4℃过夜。添加0.1% Tween-20能减少非特异性结合。对于高丰度蛋白样品可先5%脱脂奶粉封闭30分钟，再切换至3% BSA封闭1小时。当然低丰度蛋白样品需要缩短封闭时间，如室温30分钟。

4，洗膜有时也背锅

在WB实验中，洗膜不充分（时间过短或次数不足）会导致膜上残留抗体，增加非特异性结合和背景信号。建议使用pH值稳定的TBST缓冲液，将Tween-20的浓度从0.1%提升至0.2%-0.5%，减少非特异性结合。延长单次洗膜时间，比如从5分钟到10分钟，减少疏水结合。

5，电泳缓冲液偶尔也“背锅”

电泳液一般新鲜配制，用上2-3次就换了吧。配制之前需要查看试剂是否过期、浓缩液是否长菌、固体颗粒是否完全溶解，可用0.22μm滤膜除菌过滤。

6，显影的锅“偶现”

曝光强度过高或者曝光时间太久，会增加背景信号。显影液需现用现配，在30分钟内使用。根据显影液推荐范围设定曝光时间，比如从5秒开始，逐步延长至30秒、1分钟、5分钟等。