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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
入驻年限：17 年
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客服部
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北京
- 业务范围：
技术服务、试剂、抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒
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公司新闻/正文
「WB急救室」开诊，条带开口笑、拖尾、重影、弯曲、哑铃状、波浪线，可能是电泳过程出问题了
163 人阅读发布时间：2026-03-24 17:09
电泳在Western Blot中具有核心作用，是实验成功的基础，是优秀蛋白质选手脱颖而出的“大舞台”。电泳液、电压电流、凝胶3大元素贯穿整个电泳过程。某个细节的失误，可能就会让条带直接翻车成表情包：微笑条带让你怀疑“蛋白成精了”、哑铃状的怕是刚跑完马拉松、拖尾的如同被老板骂哭的打工人，更刺激的是，电泳液漏了……
电泳就像爱情，电压过猛容易“擦枪走火”，条件太弱只能“暗送秋波”，只有精准把控，才能收获完美“蛋白CP”。来，测一测你的电泳段位：
✦ 一级：电泳液配置靠蒙
✦ 二级：条带拖尾能解释
✦ 三级：根据条带形状写段Rap
言归正传，我们来说一说怎么解决电泳条带“表情包”的问题吧。
问题一：不合时宜的微笑或皱眉
1）电泳液一般新鲜配制，用上2-3次就换了吧。配制之前需要查看试剂是否过期、浓缩液是否长菌、固体颗粒是否完全溶解，可用0.22μm滤膜除菌过滤。
2）凝胶最好现用现配，凝固时间受凝胶类型、浓度、环境温度及促凝剂状态等多因素影响。分离胶凝固后，凝胶与玻璃板接触面可见清晰折射线，无液体流动。为了防止分离胶氧化加快凝固，一般用无离子水、异丙醇、无水乙醇来封闭。建议用无水乙醇，残留少无异味。凝固后立即倒掉封闭液，并用滤纸吸干残留液体，避免长时间接触导致胶面变形。吸干残留液体后灌注浓缩胶。加入较高浓度TEMED（如0.1%），可加速凝固。胶液倒入后立即插入梳子，避免胶面凝固导致孔道不平。
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凝胶类型 |
凝固时间 |
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分离胶 |
低浓度（<8%） |
20-25分钟 |
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浓度8%-12% |
约30分钟 |
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高浓度（>12%） |
40-50分钟 |
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浓缩胶 |
15-20分钟 |
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温度会影响凝胶凝固。比如将配好的聚丙烯酰胺凝胶置于37℃温箱中20-30分钟，可加速凝固。低于20℃，可适当延长20-30分钟。凝胶长时间不用可以加点水密封后放到4℃保存。
3）电压设置参考每厘米2-5V的原则，比如20cm电泳槽可设为60-100V。建议采用两段式电泳：
浓缩胶阶段：80V恒定电压，以溴酚蓝指示剂迁移为参考，约20-30分钟，使样品压缩成平直条带。
分离胶阶段：120-150V。溴酚蓝迁移至凝胶底部，约60-90分钟，提升蛋白分辨率。
若凝胶浓度>12%，需适当降低电压（如100V）。大分子量蛋白（>100 kDa）可延长分离胶时间，120V下运行90-120分钟。高电压运行时，若电流>70mA，建议暂停电泳散热或降低电压。4°C环境电泳或使用循环冷却装置以防电泳过热。
4）除了电泳过程中的问题，蛋白样品间浓度差异大或盐离子浓度差异大也可能出现“微笑”条带。建议在上样前，通过BCA或Bradford法精确测定蛋白浓度，然后根据蛋白浓度选择等质量或等体积上样。
问题二：笑到腮帮子裂开
问题三：感觉被压榨了，条带呈哑铃状
如上，凝胶现用现配，溶液充分溶解、混匀。
如果排除凝胶问题，可以考虑对蛋白样品进行处理。比如使用0.45μm或0.22μm孔径的滤膜过滤，去除微小颗粒。将样品于4°C、12,000-16,000g离心15-20分钟，去除细胞碎片、未溶解组织块等大颗粒杂质。如果样品黏度过高，可能是含有大量核酸，可以在裂解液中加入全能核酸酶，37°C孵育15分钟，减少核酸与蛋白结合形成的复合物。
问题四：条带飘忽不定，起起伏伏
1）电压设置参考上文。将电泳槽置于冰水混合物中或连接循环冷却泵，持续降低电泳槽温度，维持缓冲液温度≤15°C。
2）凝胶凝固不均一也可能会出现波浪形条带，可以按照上文提到的方法进行优化。
3）如果样品中含有细胞碎片或DNA也可能会出现这种情况，可以如上文提到的进行离心、加核酸酶等处理蛋白样品。
4）还有一种情况是转膜过程中，夹得过紧或产热过多，导致凝胶变形，造成条带扭曲。夹紧时需施加均匀压力，以玻璃棒能滚动通过且无明显阻力为宜。反复使用的海绵垫易变形，建议每5次更换新垫。常规转膜设置为恒流模式200-300mA（膜面积10×10cm），时间1-2小时。若目标蛋白>100kDa，需降低电流至150-200mA并延长转膜时间。转膜前将缓冲液置于4°C预冷，转膜槽置于冰水混合物，可降低转膜过热风险。
还有一个小技巧，在转膜液中加20%甲醇，不仅可以活化PVDF膜。还能减少凝胶溶胀导致的夹紧压力。
问题五：条带如同哈雷彗星，拖着长长的尾巴
1）凝胶现用现配，溶液充分溶解、混匀。
2）配制新鲜的电泳缓冲液，尤其是检查各种试剂是否过期（长毛的Tris-HCl真的就别用了呀！）。电泳缓冲液pH不对会影响蛋白迁移速率，常用Tris-甘氨酸缓冲液pH为8.3-8.5。
3）电泳设置合适的电压，防止产热严重造成拖尾，建议采用如上提到的两段式电泳。
4）其他如上样量大、浓度高、含有聚集体、降解、糖基化修饰等样品原因造成的条带拖尾，可以查看「WB急救室」的相关文章，这里不再赘述。
问题六：个别条带扭曲变形
1）如上文，根据凝胶类型、浓度、环境温度，选择充足的时间让凝胶完全凝固。
2）制胶时，充分混匀凝胶液后从胶板一侧缓慢加入凝胶液，每次加入移液枪中90%液体即可，避免产生气泡。
3）配制分离胶时，使用无水乙醇进行液面压平，也可除去气泡。
4）浓缩胶尽量加满胶板，梳子从两侧同时按下，避免产生气泡。
5）制胶前，充分刷洗玻璃板和梳子。用中性洗洁精可去除干涸胶体或颗粒杂质。然后用自来水冲洗至无泡沫，再用去离子水冲洗2-3次。可垂直晾干或用吹风机吹干，避免毛巾擦拭引入纤维。用无水乙醇去除有机残留物，如油渍、指纹等。
问题七：条带上坡或下坡
电泳槽漏液的几率较大。电泳槽漏液会导致电流异常、条带扭曲。灌胶前在电泳槽中加入清水，观察30分钟是否有渗漏。溴酚蓝指示带出现“笑脸”或“皱眉”状变形，可能是漏液导致。玻璃板要彻底干燥后再组装，塑料夹子需均匀施力，避免过松或过紧导致变形。密封条一般使用50次或弹性下降后进行更换。电极丝可以每月用无水乙醇擦拭，防止氧化。
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漏液位置 |
常见原因 |
解决方案 |
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玻璃板边缘 |
玻璃板磕碰破损、夹子未拧紧或密闭不良 |
更换新的玻璃板或压片，清洗接触面并重新夹紧 |
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密封条处 |
老化、安装错位或表面凹凸不平 |
更换密封条，安装时自然嵌入槽内，避免拉扯 |
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电极孔处 |
密封圈磨损或螺丝未拧紧 |
更换密封圈，粘接开胶处 |
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底部胶体连接处 |
玻璃板未对齐或胶未完全凝固 |
重新制胶，确保凝固时间充足 |
问题八：条带有重影或呈梳子状
1）如上文，根据凝胶类型、浓度、环境温度，选择充足的时间让凝胶完全凝固。
2）凝胶长时间不用可以加点水密封后放到4℃保存。当然现用现配会更好。
3）更换新的PVDF膜。
问题九：出现多条非特异性条带
电泳缓冲液长菌造成非特异条带的情况比较少见，以下情况可能更常见：
1）蛋白样品降解成多个蛋白，而这些蛋白同样可能被一抗识别。
2）目的蛋白存在多种修饰方式，如乙酰化、甲基化、糖基化、磷酸化、烷基化等。
3）目的蛋白有多个亚型，分子量存在差异。
4）一抗特异性差、降解、使用次数过多。
5）PVDF膜封闭时间不足，或者封闭液失效
6）洗膜时间过短或者次数不足，PVDF膜上残留一抗
其他原因造成的条带异常，如蛋白样品降解、浓度高、抗体不合适等，将会在「WB急救室」专题其他文章中进行详细讲述，欢迎大家订阅专题，查看相关改进方案。