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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
入驻年限：17 年
- 联系人：
客服部
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北京
- 业务范围：
技术服务、试剂、抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒
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公司新闻/正文
「WB急救室」之条带弱、无信号，蛋白样品的5大雷区，你踩过吗？
184 人阅读发布时间：2026-03-24 16:11
WB，Western Blot
一个科研界的「神级」实验，科研人的「老朋友」
却总是不经意的给你带来「致命痛苦」
条带弱、无信号、背景高、抗体失效……
一旦失败，就是36小时的再等待
不说影响论文进度，身心的煎熬有谁懂？
现在，「WB急救室」专题正式上线！我们将聚焦WB实验中的高频故障场景，以「急诊式」内容直击痛点。前面的文章，我们解析了一抗选择及使用、二抗选择等方面的“坑”，接下来我们深挖一下蛋白样品相关的“雷区”吧！
问题一：蛋白上样量少
WB每条泳道总蛋白的上样量通常为20-50μg，磷酸化蛋白可能需要50μg。保证蛋白质量的同时，上样体积不宜过多，一般为5-10μL。那么如何保证5-10μL上样液体中含有20-50μg的蛋白呢？
首先需要通过BCA或Bradford法精确测定蛋白浓度，然后根据蛋白浓度选择等质量或等体积上样。
· 等质量上样：如表格所示已测定4种样品的蛋白浓度，每个泳道的上样量为30 μg，则每个样品的上样量分别为：3.99 μL、5.74 μL、4.61 μL、2.48 μL。
|
|
样品1 |
样品2 |
样品3 |
样品4 |
|
蛋白浓度（μg/μL） |
9.41 |
6.54 |
8.12 |
15.14 |
|
蛋白体积（μL） |
3.19 |
4.59 |
3.69 |
1.98 |
|
5x loading buffer 体积（μL） |
0.8 |
1.15 |
0.92 |
0.5 |
|
电泳上样量（μL） |
3.99 |
5.74 |
4.61 |
2.48 |
以上虽然保证了蛋白质量一致，但由于浓度不一样，蛋白迁移率可能会不同，造成条带形状不一。并且高浓度蛋白的上样量很少，增加了取液难度。如果蛋白浓度过低，上样量可能会超过梳子孔的最大体积。
· 等体积上样：用提取蛋白的裂解液或超纯水稀释样品，使样品浓度达到一致。稀释浓度必须比所有样品中最低的值还要低，比如以上4个样品中最低为6.54 μg/μL，所以我们可以统一稀释到5 μg/μL，下表为制备100 μL样品所需蛋白样本和裂解液体积。稀释后的样品可分装为10 μL，每份加入2.5 μL的5 x loading buffer处理后，按照5 μL或10 μL等体积上样。
|
|
样品1 |
样品2 |
样品3 |
样品4 |
|
蛋白浓度（μg/μL） |
9.41 |
6.54 |
8.12 |
15.14 |
|
蛋白原液体积（μL） |
53.13 |
76.45 |
61.58 |
33.03 |
|
裂解液或超纯水体积（μL） |
0.8 |
1.15 |
0.92 |
0.5 |
问题二：蛋白样本发生降解（膜看起来会比较脏）
在细胞破碎时，蛋白水解酶被释放或激活，在实验过程中或样品长期保存时，可能会使蛋白降解，影响最终的实验结果，因此蛋白酶抑制剂需要在细胞裂解前加入。常用的蛋白酶抑制剂有PMSF、AEBSF、抑肽酶等。PMSF需溶于有机溶剂（如异丙醇），水溶液中易失活，需现用现配，毒性较强，操作时请做好防护。
使用较强的蛋白质提取裂解液，可降低蛋白降解概率。SDS裂解液含有10%的SDS，具有强裂解效果，能够破坏蛋白质的空间结构，裂解时间短，用于裂解困难或容易降解的样品，但仅推荐用于WB实验。强RIPA裂解液相对温和，使用范围更广，主要有效成分为：1% TritonX-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS。
除此之外，样本制备过程需全程置于冰上或4℃环境下操作。
问题三：目标蛋白不存在或表达量低
通过文献资料或数据库（如HPA）确认目的蛋白在样本中的表达情况，更换高表达细胞系，如HEK293过表达体系。还可以通过优化密码子、选择强启动子等基因工程技术提高蛋白质表达。优化诱导条件也能提高蛋白表达，如适当提高IPTG浓度（0.5-1 mM）可增强原核细胞表达，大肠杆菌在37℃诱导4-6小时可提高表达量。目的蛋白表达量较低或难提取时，可根据其在细胞中的定位，进行富集。
问题四：蛋白变性不完全
确保缓冲液含有足够的SDS，并充分煮沸样品。常规条件：100℃煮沸5-10分钟，难变性蛋白可延长至15分钟。含有DTT或β-巯基乙醇的溶液要现用现配，避免还原剂氧化失效。缓冲液pH值需维持在6.8-7.4，以保证SDS的结合效率。
问题五：蛋白裂解不充分
选择裂解强度适当的裂解液。裂解液强度主要与去污剂的种类和浓度有关。在细胞裂解时可配合使用NP-40、TritonX-100、SDS和脱氧胆酸钠这四种去垢剂。NP-40和TritonX-100属于非离子型去污剂，在1%浓度下有效破坏细胞膜。SDS和脱氧胆酸钠属于离子型去污剂。SDS能完全破坏细胞膜、细胞核，WB实验中其工作浓度通常为1-2%。脱氧胆酸钠适用于难溶于水的蛋白，如膜蛋白、核蛋白、脂蛋白等，工作浓度通常为0.25-1%。
单次裂解细胞不宜过多，义翘神州选择2x107个细胞/mL。
超声处理要充分，以裂解液变得清澈不黏稠为准。细胞培养物超声处理选择多次短暂循环方式，如打1-3秒停2-5秒，重复5-10次，超声裂解过程中在冰上操作，避免样本发热。
关于WB条带弱、无信号这一常见“疑难杂症”，我们已经从一抗、二抗、样品蛋白三个维度进行了解析。在你的实验操作中是否还遇到过其他的问题造成检测结果差吗