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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
入驻年限：17 年
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北京
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技术服务、试剂、抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒
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公司新闻/正文
「WB急救室」之条带弱、无信号，一抗攻略助你精准定位问题根源
192 人阅读发布时间：2026-03-24 16:08
WB，Western Blot
一个科研界的「神级」实验，科研人的「老朋友」
却总是不经意的给你带来「致命痛苦」
条带弱、无信号、背景高、抗体失效……
一旦失败，就是36小时的再等待
不说影响论文进度，身心的煎熬有谁懂？
现在，「WB急救室」专题正式上线！我们将聚焦WB实验中的高频故障场景，以「急诊式」内容直击痛点：
| 「WB急救室」专题 |
| 【问题诊断室】：无条带、高背景、杂带多，逐步排查直达「病源」 |
| 【操作抢救包】：封闭配方改良方案、转膜失败急救指南、显影调控技巧……手把手带你「起死回生」 |
| 【真实案例库】：高手如何煮蛋白，事半功倍选内参，期刊投稿要整膜，Checklist与抗体筛选 |
| 【专家再答疑】：评论区随时提问，资深技术专家定时回复。文章底部还有「问诊单」，欢迎填写你在WB中遇到的难题，我们将不定期邀请技术「大咖」在线解惑。 |
WB条带弱、无信号可能与一抗选择及使用有关，首篇「问题诊断室」将详细讲解一抗使用中存在的五大问题及解决方案。开启本次「问题诊断室」，让你的WB实验效率翻倍！
问题一：一抗不适用于WB实验
根据抗体说明书或官网信息，确认此抗体是否适合用于WB实验。一般抗体说明书会列出该抗体经过了哪些应用验证，比如WB、IHC、ELISA等。当然，抗体说明书没有提及的应用，也不完全表示这个抗体不适用此种免疫实验，仅说明尚未经过此种实验的验证。你可在购买前详细咨询该公司的技术支持，以便获得更多准确信息。
问题二：一抗特异性差
需要做到“知己知彼”。通过文献资料或数据库，充分了解待检样品蛋白的序列、种属、表达特性等信息。抗体说明书一般会有免疫原的描述。有时涉及商业机密不会公开抗体的免疫原序列，我们可以将样品的蛋白序列提供给厂家，由其技术支持帮忙分析序列同源性并给出使用建议。如果检测样本为蛋白片段或同型物，选择含有此片段域免疫原的抗体。一些不常见样本（如猪、牛等）同样进行抗体的免疫原序列的同源性分析，如果超过90%，可以进行尝试。
问题三：一抗浓度过低
经过验证的抗体会在说明书中标明WB推荐浓度，可以据此进行抗体稀释。首次使用一抗进行孵育时，建议根据说明书设计浓度梯度实验（如斑点印迹试验），以便选择最适的浓度进行孵育。
斑点印迹（Dot Blotting）一般操作步骤：
1，制膜：取硝酸纤维素膜，裁成需要的长度，用铅笔画出1cm×1cm的小格。
2，加样：将标准品稀释液、样品、阴性对照、阳性对照，各取2ul点在膜上正方形小格里。在点完一次后，干燥2-5分钟，再点一次。让膜干燥10-15分钟，或直至无可见水分。
3，封闭：将膜置于封闭液（如5%脱脂奶粉溶液）室温封闭1小时（或4℃过夜)。
4，孵育一抗：弃掉封闭液，加入按梯度稀释好的一抗工作液，室温震荡孵育1小时（或4℃过夜）。
5，洗膜：弃掉一抗工作液，用PBST或TBST缓冲液充分洗涤3次，每次5分钟。
6，孵育二抗：洗涤完成后，加入稀释好的二抗工作液，室温孵育1小时。
7，洗膜：弃掉一抗工作液，用PBST或TBST缓冲液充分洗涤3次，每次5分钟。
8，取出硝酸纤维素膜，用吸水纸吸去膜上多余溶液后，加入适量的发光液，均匀覆盖，室温孵育1-2分钟。显影。
斑点印迹结果图
问题四：一抗降解或失效（膜看起来黑黢黢的）
按照抗体说明书，选择合适的稀释液和保存温度。常用的稀释液包括PBS、TBST或市售抗体专用稀释液，不管选择哪种稀释液，都要明确其组分。一般建议抗体保存在-20℃，一些不含BSA和叠氮化物的抗体应保存在4℃，具体需以抗体说明书为准。
分装是避免抗体降解和污染的有效方法。收到抗体后，按照说明书进行离心，根据每次实验的常规用量进行分装。分装量不应少于10μL。抗体要避免反复冻融，一般保存于冰箱温度变化较小的区域，如冰箱后壁处，避免放置于冰箱门处。一些研究人员为了避免反复冻融造成的损失，会在抗体中添加50%（体积比）冷冻保护剂甘油。对于大多数抗体而言，这种方法可行，但仍需查阅说明书或咨询技术支持，确认抗体是否在这种保存条件下进行过稳定性测试。
光照会影响偶联抗体的活性，因此需要保存在棕色瓶中，或包裹铝箔。尤其是荧光偶联抗体易受光淬灭，在整个实验过程中都需避光操作。
问题五：一抗孵育时间不足
一抗4℃过夜孵育比常温孵育效果好。如果赶时间，可以室温孵育2h，抗体不能再回收使用。4℃孵育时间至少要超过9h。有些抗体反应“迟钝”的可能需要更长的孵育时间，如延长至2天。
WB条带弱或无条带，还与二抗、样品浓度及其他操作过程有关，我们将会在接下来的几篇文章中进行讨论，欢迎大家持续关注。如果您有哪些实验操作问题，欢迎在评论区留言，我们将会对问题进行整理后，交给专业的技术人员进行答疑！