ELISPOT实验操作技巧：献给初学者

 

ELISpot基于细胞培养和ELISA技术，能够在单细胞水平上检测细胞因子的分泌表达功能。其原理是利用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，通过酶促反应将其结果显示出来。ELISpot技术灵敏度高，比传统的ELISA高2-3个数量级（即100-1000倍）。

目前已有商业化检测细胞因子的ELISpot检测试剂盒。可检测细胞因子有干扰素（IFN-γ）、白介素（IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等）、颗粒酶（Granzyme B）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等，可检测的样品种属有人、小鼠、大鼠、猴子等。随着技术的发展，双色、多色及荧光ELISpot方法也将会得到进一步开发。

义翘神州ELISpot试剂盒采用高亲和力、高特异性、高稳定性的单克隆抗体，经预包被PVDF板、低温干燥、真空密封包装等工艺制备。ELISpot试剂盒经过严格规范的QA、QC质量管理体系验证，确保PVDF膜上预包被的抗体分布均匀、检测结果稳定。

义翘神州ELISpot试剂盒通过预包被将实验操作过程从3天缩短至2天，并减少无菌操作的步骤，提高了工作效率和降低了污染几率，实验人员可轻松、高效的完成复杂的ELISpot检测实验。

接下来我们将以义翘神州的小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒（ALP）（货号：EK50709A）为例，分享ELISpot实验操作步骤。整个过程可以概括为以下三步：

1，预包被板处理（无菌操作）

2，细胞培养（无菌操作）

3，斑点检测（不需无菌操作）

 

第一天

预包被板处理，接种细胞共培养（严格注意无菌操作）

需自备试剂或仪器：RPMI-1640培养基（或无血清培养基）、胎牛血清（FBS）、无菌PBS洗液，超净工作台、低温离心机、CO2培养箱、微量移液器及配套Tip枪头、8通道微量移液器、0.5mL和1.5mL EP管、过滤器、细胞计数器、酶联斑点分析仪等。

配制试剂：

1）阳性刺激物：按照刺激物使用说明书和本次实验用量，现用现配。

2）配制适量含5%-10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基。

操作步骤：

1. 预包被板处理（无菌操作）

1）从密封包装中取出预包板，用无菌PBS洗涤4次（200μl/孔）。

2）用含有5%-10%胎牛血清（FBS）的无菌RPMI-1640培养基（200μl/孔）对预包板进行处理，室温孵育至少30分钟。

2. 细胞培养（无菌操作）

1）弃掉孔内液体，拍干，每孔先加入100μL的刺激物。背景对照孔和阴性对照孔不加刺激物，分别加入200μL和100μL的无菌RPMI-1640培养基。

2）在阳性、阴性对照孔及实验孔中加入稀释好的细胞悬液（100μL/孔）。

注意：细胞悬液和刺激物的浓度应根据实际情况进行调整，各组设置建议如下：

Ø 背景对照组：不加细胞悬液和刺激物，仅加培养基。

Ø 阴性对照组：不加刺激物，加入和实验组细胞数量一样的细胞悬液。

Ø 阳性对照组：加入工作浓度的阳性刺激物，如刀豆蛋白A（ConA）常用浓度为0.25-2.5μg/mL。建议加入的细胞数比实验组少，如1 x 10⁵ cells/孔。

Ø 实验组：根据实验设计加入合适浓度的刺激物。刺激物可用无血清培养基或者RPMI1640 配制成10倍储存液，使用时用培养基稀释至1倍浓度。建议细胞总数为1.5-2.5 x 10⁵ cells/孔。

建议在进行ELISpot实验时设置2-3个复孔。

 

3）细胞培养孵育：

加样完成后，盖好板盖，放入37℃、5% CO2培养箱静置培养18-48h。孵育期间避免晃动或移动板子，建议用封口膜或铝箔纸封严，避免蒸发。

Tips：加入细胞后，不要震动或拍击ELISpot板，防止细胞成圈分布在孔的外周，不利于斑点形成。培养时ELISpot板间不能叠放，叠放可能会造成整块板温度不均匀，出现边缘效应。板的碰撞或移动还可能会造成细胞移位，导致斑点模糊、拖尾、一个细胞生成多个斑点等。

Tips：细胞状态直接影响ELISpot检测结果，需选用细胞状态好、活力高、功能保持完成的细胞进行实验。新鲜分离的原代细胞，需尽量减少分离过程中的机械损伤及有害化学物质对细胞的损害。冻存复苏的细胞，可在37°C新鲜培养基中放置1小时或更长时间，提高细胞性能。

第二天

斑点检测

配制试剂：

Tips：以下试剂均需现用现配。PBS应用0.2µm滤膜进行过滤。在洗涤和孵育缓冲液中避免使用吐温或其他去污剂。

检测抗体：按说明书推荐倍数，用含有0.5% FBS的PBS（PBS-0.5% FBS）稀释检测抗体。如义翘神州小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒（ALP）（货号：EK50709A）建议按照1:350稀释检测抗体。建议用0.2µm滤膜过滤。

链酶亲和素（Streptavidin-ALP）：按说明书推荐倍数，用含有0.5% FBS的PBS（PBS-0.5% FBS）稀释Streptavidin-ALP，如用PBS-0.5% FBS按照1:170稀释。建议用0.2µm滤膜过滤。

显色液：显色液配制比较繁琐，一定要看清试剂标签。如小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒（ALP）中，需将BCIP/NBT-plus溶液A与稀释液按1:250的体积比进行混合，然后加入与溶液A等体积的溶液B，即BCIP/NBT-plus溶液A、稀释液、溶液B的体积比为1:250:1。

操作步骤：

3. 低渗裂解细胞：从培养箱中取出ELISpot板，弃掉孔内液体，在滤纸上拍干。然后在每孔中加入200μL 4°C预冷的去离子水，置于4°C冰箱10min。

Tips：利用去离子的水低渗作用诱导细胞膨胀和裂解，更容易在洗板过程中将其去除，否则会影响斑点的形成。

4. 洗板：完成裂解后，弃掉孔内液体并拍干。接着每孔中加入200μL无菌的PBS，浸泡1min。然后弃掉孔内液体，拍干。重复洗板操作5次。

5. 检测抗体孵育：每孔加入100μL稀释好的检测抗体，室温条件下孵育2h。

6. 洗板：抗体孵育结束后，弃掉孔内液体并拍干。然后向每孔中加入200μL无菌的PBS进行洗板。重复洗板5次。

7. Streptavidin-ALP孵育：每孔加入100μL稀释好的Streptavidin-ALP，室温条件下孵育1h。

8. 洗板：抗体孵育结束后，弃掉孔内液体并拍干。然后向每孔中加入200μL无菌的PBS进行洗板。重复洗板5次。

9. 显色：每孔加入100μL底物显色液，室温避光孵育5-30 min，根据斑点生成情况选择终止显色时间。

Tips：显色反应通常发生在10-30 min，通过目视监测斑点的形成过程。

10. 终止反应：待斑点出现后，用大量自来水或去离子水冲洗。建议揭开板底座，冲洗膜的底部。

11. 读数：将ELISpot板放置在室温阴凉处，待板完全干燥后再进行读数。可使用斑点分析仪或显微镜进行斑点计数及分析。

Tips：请勿在高于37°C的温度下干燥膜板，否则可能导致膜破裂。斑点计数时，应注意区分由纤维、膜撕裂、碎片等导致的不规则斑点，一般细胞生成的斑点通常为圆形。

 

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