单细胞水平检测细胞因子分泌动态——ELISPOT

在肿瘤免疫治疗、疫苗评价和感染性疾病研究领域，研究人员面临着一个挑战：如何在几十万、几百万的细胞中，精准定位细胞信号转导过程？这项诞生于1983年的技术正在悄然改变免疫学检测格局——它就是能够在单细胞水平对细胞因子进行动态监测的技术ELISpot。

 

ELISpot技术原理

ELISpot的全称是Enzyme-linked Immunospot Assay（酶联免疫斑点技术）。这个名字本身就暗藏玄机，既不是ELISA的简单升级，也非普通细胞培养实验，而是将两者巧妙融合后诞生的单细胞功能检测技术。

ELISpot的原理是：免疫细胞被刺激物激活，分泌细胞因子或免疫球蛋白，而ELISpot板底的PVDF膜上包被有特异性抗体，能够捕获免疫细胞的分泌物。然后通过免疫酶联标记技术将包被抗体捕获的细胞因子以斑点的形式显示出来。简单来说就是“酶联免疫”加“斑点”。

ELISpot技术核心原理可以概括为四步：

1，ELISpot实验可以在96孔上进行，每个板孔底部（常为平底）铺有一层PVDF膜。膜上包被高特异性的单克隆抗体，用于捕获细胞分泌的细胞因子。

2，将待测细胞和刺激物进行共培养。待测细胞为PBMC、脾细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等活细胞。刺激物可以是伴刀豆蛋白A（ConA）、多肽、重组蛋白、CD3抗体等。在刺激物作用下，免疫细胞会在对应的时间段分泌对应的细胞因子。细胞因子将会被包被在膜上的抗体特异性捕获。

3，清除细胞，加入生物素标记的二抗，进行酶联反应。

4，加入底物显色，在膜上形成肉眼可见的斑点。一个斑点代表一个阳性细胞，通过读板仪器可以统计阳性细胞数量。阳性细胞率（%）=（膜上斑点数/孔内细胞总数）×100%

 

ELISpot三大颠覆性优势

一、灵敏度高达0.000001（百万分之一）

一百万个细胞中只要有一个细胞分泌靶细胞因子，就可以被ELISpot检测出来，比传统ELISA的灵敏度高出2-3个数量级。在共培养过程中，免疫细胞分泌的细胞因子可被其周围的抗体瞬间捕获，避免了ELISA样品处理过程中的蛋白稀释、降解等损失。

二、单细胞水平，活细胞功能检测

ELISpot不需要固定、破膜等处理步骤，直接检测细胞的天然分泌物质。以细胞因子为例，检测结果中出现的斑点是其累积产生的“印迹”，是活细胞动态分泌过程的最终体现。因此，ELISpot反映细胞分泌全过程，直观体现细胞免疫反应的强弱，避免假阳性细胞的误判。

三、操作简便，高通量筛选

标准化96孔板设计，没有复杂的细胞体外增殖过程，试剂盒操作简单，一个实验者可以同时处理数百个样品。检测结果直观可信，斑点代表分泌细胞因子的细胞，斑点晕的强弱与细胞分子分泌量呈正相关。

 

横向比较：ELISpot vs. ELISA及流式细胞术

ELISA（酶联免疫吸附实验）用于免疫反应的定性和定量检测。利用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线定量可溶性蛋白含量。ELISpot不仅能检测细胞因子分泌总量的变化，还能检测活细胞的数量变化。概括来说，ELISA是对“无生命”的样本溶液中靶蛋白的浓度进行定量检测，ELISpot是对样本中活细胞免疫状态进行动态检测。

ELISpot与ELISA的相似与不同之处

	ELISpot	ELISA
待测蛋白来源	细胞培养物（直接检测培养中的细胞分泌情况）	样品活细胞中即时分泌的细胞因子或抗体
固相结合方式	通过一抗（捕获抗体）
检测	二抗（检测抗体）
酶标记	HRP、ALP
显色底物	不可溶	可溶
检测结果	在培养孔底形成的有色底物斑点，经光学放大后肉眼可见	溶解于水中的有色底物的颜色强度或吸光度
定量方法	显微镜下人工计数或自动化视觉分析系统计数	光度法（检测有色物质的吸光度）
结果指标	分泌目标蛋白的细胞数量，有时可进一步分类（大斑点-小斑点）	目标蛋白的浓度
检测水平	单细胞水平（理论上）	取决于检测系统（通常为ng/ml）
检测时间点	培养结束时（斑点形成需终止微培养）	培养期间的任意时间（可收集上清样本并补充新鲜培养基）

缩写：HRP（辣根过氧化物酶）；ALP（碱性磷酸酶）

 

ELISpot和流式细胞术（FCM）各具特色，各有千秋，都是功能强大的细胞分析技术，从不同的维度检测细胞功能。

ELISpot关注活细胞分泌蛋白总量随时间的累积结果，FCM反映细胞某个瞬间的“静态快照”，是细胞通过固定和通透后检测到的细胞内部储存的蛋白量。

在灵敏度上，ELISpot在检测低表达蛋白方面比FCM灵敏。因为ELISpot通过16-24小时的共培养过程，将信号放大，能捕捉到分泌量虽少但持续分泌的细胞。

在数据分析方面，ELISpot提供单一因子检测结果，其升级版FluoroSpot可实现多因子检测，但更侧重于对某一特定功能的深度定量。FCM最大的优势就在于多参数分析能力，在检测胞内因子的同时，还分析该细胞的表型（CD4+或CD8+）、分化状态（记忆或效应细胞）及其他多功能研究。

 

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