ELISpot操作常见问题及优化方案

酶联免疫斑点检测（ELISpot）是基于单细胞水平检测细胞因子分泌频率的免疫学技术，已广泛用于疫苗效价评估、细胞治疗免疫原性评价、药物筛选等研究领域。ELISpot实验操作较简单，如何才能让小小斑点“圆润精致有核晕”呢？

ELISpot结果常见问题

1，斑点过多或过少

在ELISpot实验中有多种因素能够影响斑点的形成，如细胞生长状态、密度，PVDF膜的材质或处理方式，包被抗体、检测抗体的质量，刺激物的特异性及刺激时间，洗板是否充分，以及内毒素污染、培养基不稳定、细胞凋亡等干扰因素。 

优化建议：

• 通过预实验调整细胞数量、抗体浓度及孵育时间。
• 设立阴性对照、阳性对照。

2. 有空白区域

在早期ELISpot实验或需要包被捕获抗体的操作中常见，主要是PVDF膜活化的问题。比如膜质量问题、乙醇活化过程中发生渗漏。 

优化建议：

• 选择预包被ELISpot，省去乙醇活化操作，用含有5%-10%胎牛血清（FBS）的无菌RPMI-1640培养基（200μl/孔）对预包板进行处理，室温孵育至少30分钟。
• 乙醇处理后立即加水稀释，避免活化过度对膜造成损伤。

3. 背景颜色深

主要原因是洗板不充分，也可能是膜未完全干透就进行检测。

 优化建议：

• 洗板要充分。每孔中加入200μL无菌的PBS，浸泡1min。然后弃掉孔内液体，拍干。重复洗板操作5次。
• 用预冷的PBS洗涤可减少背景信号。
• 显色液要过滤后使用，终止显色反应时使用纯PBS，避免使用自来水。

 

4. 细胞凋亡对结果的影响

细胞凋亡或死亡会造成ELISpot实验结果高背景、无斑点。据统计细胞凋亡比例达到30%，结果将完全不会出现斑点。即使凋亡比例达到5%也会严重影响结果。

 

优化建议：

•  细胞制备及处理阶段，注意无菌操作，温和处理细胞保证细胞活率，洗涤细胞用预冷PBS减少细胞应激反应。
• 预孵育或者密度梯度离心去除死细胞后，再做ELISpot实验。

 

ELISpot实验操作不规范，也会造成背景深、边缘效应及斑点成团、模糊、减少等问题，详见下表汇总。

问题描述	可能原因	优化建议
PVDF膜背景深、着色重	洗板不彻底 膜是湿的，未干透	提高洗板次数，保证每次浸泡1 min PVDF膜板完全干透后再读板
阴性对照孔出现斑点	培养基、血清或DMSO中的内毒素或其他污染物激活细胞 细胞被污染 细胞活率低	使用无内毒素的试剂 在板处理和细胞培养过程中严格无菌操作 优化细胞分离提取流程，确保细胞的活性及功能性，建议细胞活率> 90%
阳性对照孔斑点数少或模糊	酶活力下降 显色试剂温度低，出现氧化现象 刺激物效价低	提高酶浓度 显色试剂使用前平衡至室温，勿使用已出现氧化沉淀的试剂 提高刺激物浓度
斑点形状不达标或成团	细胞破碎 细胞聚集	优化细胞分离提取流程，确保细胞活性 细胞悬液充分混匀，确保呈单细胞状态
斑点位置不均匀，存在边缘效应	铺板后震动细胞板，造成细胞位移 加入刺激物时力度过大，冲散细胞悬液 细胞培养时ELISpot板叠放	在铺板完成后，尽量不要晃动细胞板，轻缓平移放入培养箱 采取先加刺激物后加细胞的方式 将每块板单独放在架子上，使热量均匀分布到每个孔
孔中斑点密集	斑点融合在一起，无法区分单个斑点	减少加入孔中的细胞数量

 

如何获得理想的ELISpot结果

若想获得清晰、可靠的ELISpot结果，除了对原理的充分理解，更要把控实验操作细节。理想的ELISpot斑点通常呈圆形，具有致密的中心和向边缘逐渐变浅的“核晕”。而细胞碎片、非特异性结合造成的假斑点，常常形态不规则、边缘锐利或颜色不均一。

决定ELISpot实验成败的三大关键因素有：

1，细胞样品活力与状态

低活力或处理不当的细胞无法对刺激做出有效反应，导致斑点微弱或无斑点。血液来源的免疫细胞是ELISpot常用的样本类型，建议选择柠檬酸钠或肝素钠抗凝剂进行采血。Wield避免粒细胞污染，应在采血3小时内完成细胞培养。

对于冻存细胞，可在复苏后先置于新鲜培养基中，在37℃放置1小时或更长时间。镜检细胞，恢复圆润透亮状态后再进行后续的铺板培养。

2，设置正确的对照

ELISpot实验至少要设置3组对照：

背景对照组：不加细胞悬液和刺激物，仅加培养基，用于排除由试剂或其它介质产生的非特异性斑点。

阴性对照组：不加刺激物，加入和实验组细胞数量一样的细胞悬液，用于确认可自发分泌细胞因子的细胞个数。

阳性对照组：加入阳性刺激物，如刀豆蛋白A（ConA）。用于确定试剂盒的质量、操作步骤和细胞功能的完整性。

阳性刺激物种类较多，主要分为非特异性刺激物和特异性刺激物。非特异性刺激物可激活大部分免疫细胞，使其分泌细胞因子，如PHA、ConA、PMA、LPS等。特异性刺激物包括特异性肽池（Peptide pool）、特异性抗原蛋白（OVA）或肽段（CMV Peptide）等，需根据实验实际需求进行选择。

 

常见非特异阳性刺激物
名称	常刺激细胞
植物凝血素（PHA）	刺激人或猴T淋巴细胞
刀豆蛋白A（ConA）	刺激鼠T淋巴细胞
离子霉素/佛波酯（Ionomycin/PMA）	对各类淋巴细胞有较好刺激作用
细菌脂多糖（LPS）	刺激鼠B细胞

3，洗板是关键操作

在ELISpot实验，洗板操作包括低渗裂解细胞后、检测抗体孵育后及酶孵育后。每次洗板需要重复4-6次，且建议洗液浸泡1分钟。充分洗板能有效减少背景着色，减少细胞碎片，让斑点清晰可数

 

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