Pull-down解析蛋白功能：截短体如何设计？结果如何读

Pull-down不仅回答“是否结合”，更重要的是解析“如何结合”。

 

蛋白互作（Protein-Protein Interaction, PPI）是信号转导调控、代谢调控、疾病发生发展的基础机制。Co-IP、Pull-down实验首先用于回答“两个蛋白是否存在互作”。同一套实验设计，能不能用于深入剖析蛋白质功能呢？比如：

 

结合的特定区域或位点是什么？

互作是否依赖其他蛋白或细胞环境？

结合过程受哪些蛋白修饰或信号分子调控？

 

接下来，我们结合发表于FEBS Open Bio的文章，分享一个可在普通分子生物学实验室开展的、低成本快速体外蛋白互作研究实验方案，重点在截短体的设计思路与结果验证。

 

大部分蛋白具有多个功能结构域，如N端、C端、独立结构域等。通过构建截短体或结构域缺失可进一步定位参与催化、互作的关键区域。

一、典型的设计思路

 

①　根据数据库蛋白结构信息，将其分为N端、中间区域和C端片段；

 

②　选择合适的载体进行表达；

 

③　在相同实验条件下进行Pull-down检测；

 

④　根据互作信号强弱确定参与互作的区域；

 

⑤　还可进一步缩小截短体范围，获得最小结合结构域。

 

源自文献：doi:10.1002/2211-5463.13485

 

研究人员通过构建一系列CENP-C蛋白C端的截短片段，逐步缩小范围，鉴定出介导CENP与Falafel（Flfl^N）直接结合的功能区域（FBD, Falafel-binding domain）。

二、实验设计

 

· 诱饵蛋白（Bait）：GST标签融合表达的Falafel N端片段（GST::Flfl^N），固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上。单独GST标签蛋白作为阴性对照，排除非特异性结合。

 

· 猎物蛋白（Prey）：11段CENP-C截短片段，通过体外偶联转录翻译（IVTT）合成，并用35S-甲硫氨酸进行放射性标记，用于SDS-PAGE放射自显影检测。

三、实验结果

 

· 左侧：CENP-C截短体示意图，顶部是其C端的全长序列参考（788-1411位氨基酸，CEN保守结构域1099-1121）。C1-C11是11个相互重叠的截短片段，数字代表氨基酸位点，红色片段位定位的核心结合区，蓝色为非结合/部分重叠片段。

 

· 中间：结合结果汇总。“+”表示能与Flfl^N特异性结合，“-”表示无明显结合。

 

· 右侧：Pull-down放射自显影检测结果。IVTT input表示猎物蛋白是上样对照，结果显示所有截短体均在体外表达，实验体系有效。GST阴性对照组，验证蛋白不与GST标签蛋白或珠子进行非特异结合。实验组（GST::Flfl^N）存在条带即代表该截短体与Flfl^N特异性结合。

四、结果解读

 

实验设计采用“逐步缩短+重叠验证”的策略，精准定位结合区域（1002-1093 aa）：

 

第一轮：大范围初筛。

 

C1（-）表示790-1001无结合位点，C2（+）表示1002-1201包含结合位点，C3（-）即1202-1411无结合位点。初步锁定结合区域在1002-1201之间。

 

第二轮：细分区间。

 

C4（+）结合位点在894-1099之间，C5（-）即1100-1305间无结合位点。C6（+）进一步缩小范围，结合位点在1002-1099之间，C7（-）再次确认1100之后无结合位点。

 

第三轮：锁定结合域。

 

C8（+）即1002-1121可结合，C9（+）表示1002-1093间仍可结合，C10（-）而1094-1201间不结合，C11（-）进一步验证1122-1201间无结合位点。

 

截短体input具有清晰条带，部分有提前终止产物或降解条带（★）不影响主带的结合判断，说明猎物蛋白均表达成功，实验体系可用。GST阴性对照几乎无条带（仅个别有较弱背景），说明Flfl^N与CENP-C的结合是特异性互作。定位出的FBD（1002-1093）位于CEN结构域（1099-1121）的N端侧，两者紧邻但不重叠，提升PP4磷酸酶通过该位点被招募到着丝粒核心区域，参与着丝粒的功能调控。