「翘客」技术手册：无血清培养条件下，如何提升MSC扩增效率？重组人纤连蛋白包被优化实操

血清不仅提供细胞生长增殖所需的营养，还含有能够促进细胞粘附的成分。去除血清后，贴壁依赖型MSC所处的细胞-基质环境会发生改变。纤连蛋白（Fibronectin）属于细胞外基质（ECM）组成蛋白，可与整合素（Integrin）相互作用，支持细胞黏附、铺展和增殖。

Rajaraman等比较了纤连蛋白、胶原、明胶、层粘连蛋白等多种基质对人子宫内膜MSC（eMSC）无血清培养的影响。结果显示，在多种无血清或无动物源成分培养基中，纤连蛋白包被表现具有较强的细胞黏附支持作用。Heathman等人开发的hMSC无血清培养工艺中，将纤连蛋白预包被到微载体表面，6天后细胞密度达到3.01×10⁵ cells/mL，扩增倍数约为10.04。收获后法细胞活率达到99.63%，保持MSC相关表型和多向分化能力。

MSC在不同基质和培养基中的生长速率（源自文献：DOI: 10.1089/ten.tec.2011.0718）

为获得更好的培养结果，本实验设置多个纤连蛋白包被浓度，并以未包被组和含5% FBS培养条件作为参照，从而比较不同培养条件对细胞状态的影响。

实验使用购自义翘神州的重组人纤连蛋白（Cat. 10314-H08H）。

·按照商家提供的CoA，用ddH₂O重溶纤连蛋白，并于-80℃储存。

· 用PBS将纤连蛋白稀释至100μg/mL，储存在-20℃。

· 取10μL纤连蛋白（100μg/mL）与290μL PBS混合并充分混匀，纤连蛋白终浓度为3.3μg/mL。现配现用。

· 在培养板每孔中加入300μL MSCs培养包被液，轻轻摇晃以确保基质均匀覆盖孔底。将培养板转移至37℃培养箱中孵育1小时或过夜。

注：24孔板每孔使用300μL，6孔板每孔使用1.5mL。24孔板每孔底面积约为2cm²，6孔板约为9.6cm²。

包被浓度以μg/cm²为标准单位。计算公式为：

表面包被量（μg/cm²）=工作液浓度（μg/mL）×加液体积（mL）÷培养面积（cm²）

多数情况下用培养板孔底面积代替培养面积进行计算。

· 吸弃待传代MSCs的培养上清液，加入300μL PBS洗涤。

· 吸弃PBS，加入300μL TrypLE™ Select胰蛋白酶替代物，室温孵育1分钟。

· 将细胞以300 × g离心5分钟，用MSCs培养基重悬细胞至适当浓度。

· 取纤连蛋白包被板，吸弃孔中的包被液，加入细胞悬液。24孔板中，每孔接种7×10⁴个细胞。

· 每两天更换一次MSCs培养基，4-5天进行一次传代。

· 当细胞培养至第三代时，检测细胞增殖及标志物表达情况。

从图中可以看出，不添加纤连蛋白的无血清培养基中，MSCs的贴壁和生长状态较差。随着纤连蛋白包被浓度从0.1μg/cm²逐渐增加至0.5μg/cm²，贴壁细胞的数量和状态变好。其中0.5μg/cm²浓度的MSCs生长状态与添加5%胎牛血清（FBS）培养的对照组相近。结果说明提供足够的纤连蛋白对于改善MSC在无血清培养环境中的贴壁生长具有明显作用。

结合图一，提高纤连蛋白包被浓度能够显著增强细胞的贴壁能力与活力。当包被浓度达到0.5 μg/cm²时，细胞的贴壁效果和活率均与传统含胎牛血清（FBS）的培养体系相当。

MSCs连续传代结果进一步证明细胞扩增依赖纤连蛋白的浓度。0.50 μg/cm²组的扩增表现整体与5% FBS组接近。相较于0.25 μg/cm²和0.1 μg/cm²的包被浓度，0.5 μg/cm²能更好地满足细胞生长需求，且培养和增殖效果与传统血清体系相当。因此，我们选择该浓度作为后续实验的标准条件。

为验证该无血清培养体系能否促进MSCs扩增并维持其核心生物学特性，研究人员在细胞连续传代三次后进行流式细胞术分析。结果显示，细胞持续高表达MSCs标志性表面抗原CD73、CD90和CD105（阳性率均>99%），且不表达CD45、CD34、CD14、CD19及HLA-DR等非MSCs标志物（阳性率均<1%）。上述免疫表型符合国际细胞治疗学会（ISCT）制定的MSCs鉴定标准，表明在该无血清体系下培养的MSCs纯度高，且异质性低。

综上所述，采用0.5μg/cm²纤连蛋白包被的无血清培养体系可有效支持MSCs的连续扩增，同时保持其稳定的生物学特性，为获取适用于临床应用的MSCs来源提供了可靠策略。