奇怪！这种碱性染料竟要配成酸性溶液？分享免疫组化实验中HE染色的机制

在显微镜下，那些蓝紫相间的细胞核与粉红交织的细胞质，构成了独特的“生命画卷”。这正是HE染色（Hematoxylin-Eosin Staining，即苏木素-伊红染色）的直观艺术体现。HE染色仅用两种染料就勾勒出细胞的形态及组织的架构。

HE染色的微观探索之路已跨越三个世纪，可以追溯到19世纪末。时至今日，HE染色已成为病理学、组织学研究和临床诊断不可或缺的工具。

HE染色的原理在于不同细胞结构与染色剂的亲和力，即利用细胞成分的酸碱特性与染料选择性结合。通过物理吸附和化学反应双重机制实现对组织和细胞的染色。物理吸附使染料附着于组织表面，并通过稳定的离子键或氢键使染料牢固结合与特定细胞结构，确保了染色的稳定性。

pH值的精确调控是HE染色成功的关键。苏木素是碱性染料，可将组织中的核糖体、细胞核和细胞质中的核糖核酸等嗜碱性成分染成蓝紫色。伊红是酸性染料，可将细胞质中的嗜酸性蛋白质或其它成分染成粉红色。双重染色使细胞核和细胞质区分开来。

苏木素（Hematoxylin）染色需要多步转化过程。苏木素是一种从苏木树中提取的天然染料，无色或淡黄色粉末，易溶于乙醇和热水。在使用前需经过氧化处理形成苏木红，然后与媒染剂（通常为铝盐）结合，形成带正电荷的复合物。

细胞核内的染色质主要为脱氧核糖核酸（DNA）。在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使其外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素以离子键或氢键结合而被染，将细胞核染成蓝色。

染料的酸碱性≠溶液 pH

苏木素染液（如常用配方Harris、Gill、Mayer）为酸性（pH 2.0-3.0），但我们常常称其为碱性染料。这一矛盾的现象是怎么回事呢？可从溶液的配制、染色机制和染料分类标准3个维度进行分析。

首先，在苏木素染液的配方中会加入CH3COOH，提供酸性环境。因为苏木素的氧化过程需要酸性条件，且在pH 2.0-3.0时铝离子才能与苏木红结合形成稳定的蓝色色淀。如果是碱性会生成氢氧化铝沉淀，造成染色失败。

其次，酸性条件下苏木素通过带正电荷的染料-媒染剂复合物选择性结合带负电的DNA，不会与细胞质染色，减少非特异性染色，让细胞核着色更精准、更清晰。

最后，碱性染料指的是染料本身的化学性质（带正电荷），而不是说它配成的溶液呈碱性。

总之，苏木素引起活性染色基团带正电荷，属于碱性染料。但为了获得背景清晰的染色结果，需要将其配制成酸性溶液。

除细胞核外，其他含酸性物质的成分也能与苏木素结合而呈蓝色或蓝紫色。如软骨基质中含有硫酸软骨素等酸性多糖，在HE染色中为淡蓝紫色，钙化灶/骨质呈深蓝紫色至紫黑色，黏液为灰蓝色。这些染色特性是病理诊断的重要信息。

伊红的染色机制则相对简单但同样精妙。伊红（Eosin）是一种化学合成的酸性染料，有水溶和醇溶两种形式，常用的是水溶性伊红Y（Eosin Y）。伊红对细胞质、胶原纤维、红细胞内的血红蛋白等具有强烈的亲和力。

伊红在水中解离成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合，使细胞质、红细胞、胶原纤维等呈现不同程度的红色或粉红色。蛋白质为两性化合物，等电点为4.0-7.0。当溶液pH值低于等电点时蛋白质带正电荷，而高于等电点时带负电荷，因此在伊红溶液中加入少量CH3COOH，可以维持弱酸性，使蛋白质被伊红染色。

红细胞因含有血红蛋白，与伊红结合后呈现鲜艳的橙红色，胶原纤维呈淡粉红色，肌肉纤维呈深粉红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。这些差异化的染色结果有利于观察组织结构。

值得注意的是，苏木素染色后必须经过“分化”和“返蓝”两个关键步骤。

分化使用1%盐酸乙醇短暂处理，去除细胞核过多结合的苏木素染料和细胞质吸附的苏木素染料，保证细胞核与细胞质染色分明。分化不足会造成核质界限模糊，背景过深。分化过度使细胞核褪色，结构不清。可在显微镜下实时观察，待细胞核清晰、细胞质基本无色时停止分化，立即用水冲洗组织切片上的酸。

返蓝是在分化后用弱碱性水冲洗，如用0.2%NH₃·H₂0浸洗处理30秒至2分钟，以增强染色对比度。返蓝的充分程度将直接影响细胞核呈现效果。返蓝不足细胞核呈红紫色或灰蓝色，返蓝充分细胞核呈纯净的蓝色或蓝紫色。除NH₃·H₂0外，流动自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长（20-40分钟）。