「ELISA问诊室」NaIO4vsC5H8O2：如何实现HRP与抗体的“焊接”？

NaIO4的偶联过程可以分为3个关键阶段：氧化-偶联-还原。

· 氧化阶段：以HRP酶为作用对象，NaIO4作为氧化剂将酶中的糖类分子氧化，使糖结构中的邻二醇基团转化为醛基（-CHO）。

· 偶联阶段：抗体分子上游离的胺基（-NH2）与酶的醛基反应，形成席夫碱（Schiff base），含有不稳定的亚胺键（-C=N-）。

· 还原阶段：加入NaBH4或其类似物进行还原反应，将不稳定的亚胺键还原为稳定的碳-氮单键（-CH2-NH-），使抗体与HRP形成不可逆的共价连接，最终生成稳定的HRP-抗体偶联物。

NaIO4标记原理（源自文献：Abuknesha, R. et al. Labeling of biotin antibodies with horseradish peroxidase using cyanuric chloride. Doi: 10.1038/nprot.2009.6）

基于以上原理，NaIO4法标记抗体主要有以下操作步骤：

1）抗体处理

抗体中如果含有Tris、NH4⁺等离子，需要透析处理。

吸取2mg抗体到透析袋中，将抗体浓度调整到4mg/mL。将透析袋放入pH 9.5、20mM的碳酸盐缓冲液中透析3h，每1h换一次缓冲液。

2）HRP氧化

称取4mg HRP溶于1mL ddH2O中，加入0.2mL新鲜配制的0.1 M的NaIO4溶液，轻轻晃动混匀。4℃避光搅拌反应20-30min，溶液由棕黄色变成墨绿色。

3）终止氧化

取4 μL乙二醇至40μL ddH2O中，充分混匀后全部加入氧化好的HRP中，4℃避光搅拌反应20-30min，溶液由墨绿色变为黄褐色。

4）标记抗体

调整HRP溶液的pH至9.5（常用20mM 碳酸盐缓冲液调），然后加入到透析好的抗体中混匀，4℃避光反应4h，或25℃避光反应1-4小时。

5）终止标记

称取0.2mg的NaHB4，溶解于40μL ddH2O中（现用现配），全部加入上述反应液中，4℃避光反应1h，每10min摇一次。

6）纯化保存

在pH 7.4、20mM的PBS中4℃避光透析过夜，建议中途换1-2次PBS。然后在标记液中加入等体积的甘油，混匀后在-20℃保存。

C5H8O2含有两个醛基，其中之一可与HRP酶的赖氨酸结合，另一个可与抗体上的氨基结合，形成酶-C5H8O2-抗体复合物。C5H8O2交联法标记步骤简单，重复性好，但酶的利用率较低。

C5H8O2交联法分为一步法和两步法。

一步法就是“大锅炖”，将HRP、抗体、C5H8O2按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的C5H8O2，制得酶标抗体。但由于抗体蛋白中的氨基远多于HRP的，与C5H8O2反应快，造成抗体易形成较大的聚合体，而与酶分子交联减少，影响酶的标记。标记率约1%-5%，难以获得理想的酶标抗体。因此二步法较常用，我们将重点介绍二步法的操作步骤。

两步法通过"先活化酶、再偶联抗体"的策略，有效规避这一问题，是目前的主流选择：

1）称取10mg HRP，溶于200μL含1.25%（V/V）的0.1M pH 6.8的PBS中，室温避光放置18-24h。

2）充分透析（pH 9.5、20mM的碳酸盐缓冲液）或SephadexG-25柱层析（150 mM NaCl平衡）处理，以除去未反应的C5H8O2，收集活化的HRP。

3）将浓缩活化的HRP浓度调至10mg/mL左右，并调pH至9.5，然后加入5mg 抗体，4℃避光24h。

4）加入100μL 0.2mol/L赖氨酸，室温静置2h终止反应。以20mM pH7.2的PBS充分透析，离心去除沉淀，上清为酶结合物，然后加入等体积的甘油，混匀后在-20℃保存。

1）重要试剂需要现用现配，如NaIO4、NaBH4、HRP等。NaIO4遇水迅速分解，务必在干燥环境中称重；

2）避光！避光！避光！重要的步骤说三遍；

3）透析袋需要提前煮沸10min，以去除重金属残留；

4）若偶联后，酶标记物出现沉淀，可8000g 离心10min去除杂质，再测酶活与效价；

5）避免反复冻融，若长期保存需分装冻存。使用前在4℃缓慢融化。