「ELISA问诊室」破解ELISA的“色号密码”，这份避坑指南让ELISA背景直降80%！

目前市场上已有成熟的TMB显色液销售，多为单组分或双组份。我们基本已经不再配制显色液。在这里，我们扒拉了几个“秘方”，重温一下经典记忆，以备不时之需。

显色操作简单，概述如下：

1，每孔加入100μl 或200μl TMB显色液，盖上覆膜，37℃避光孵育10-20分钟。根据颜色的实际变化，适时终止反应，一般不超过30分钟。当标准品孔中出现蓝色梯度时可终止反应。

2，提前打开酶标仪预热15分钟。

3，显色后，孔内液体不可弃掉，立即加入50μl或100μl反应终止液（如2M H2SO4）。颜色由蓝色立即变为黄色。添加终止液的顺序应与添加TMB底物的顺序一致。

酶标仪在450nm处读取OD值，一般在30分钟内完成读值。  

显色作为ELISA中的最后一步反应，将直接决定实验的成败。反应温度和时间是影响显色的关键因素。定性检测可在室温进行，时间要求不严格，可根据标准品、对照孔的显色情况判断。在定量检测中就要严格按照规定操作，力求准确。

以下是ELISA显色异常结果汇总：

1，背景颜色过深

可能原因：

· 洗板不充分，残留物与底物反应

· 封闭不彻底，导致非特异性吸附

· 底物孵育时间过长、TMB浓度过高、酶结合物浓度过高等。

2，显色过浅或无颜色

可能原因：

· 样品含量低

· 酶结合物失活，如酶标一抗、酶标二抗等

· 底物孵育温度过低或时间过短

· 底物变质失活

3，显色结果不稳定

可能原因：

· 底物保存不当或过期

· 实验室中的温度、湿度变化较大

· 操作过程中移液速度、力度不均衡

4，显色颜色非蓝色

可能原因：

· 底物过度氧化会变成褐色或棕色

· 底物浓度过高会导致颜色集中，显示为深蓝色或黑褐色

· HRP酶结合物工作液浓度过高，或样品浓度远高于检测范围时，会出现墨绿色或深蓝色

当pH值发生变化时，颜色也会变化。加酸颜色会变浅，从蓝色到绿色再到黄色

5，TMB底物在使用前变色

可能原因：

· 环境中存在氧化物，比如血液、汗液中存在过氧化物酶

· TMB要现用现配，低温避光保存。时间长了、反复使用、不避光都可能造成氧化

· 避免被H2O2、漂白剂、清洁剂等污染

6，显色后蓝色迅速消失

可能原因：

显色系统中存在还原性物质，比如水、buffer或试剂中含有Fe2+或乙醇等。

7，加入终止液后，孔中液体变黑或产生黑色沉淀

可能原因：

· HRP酶结合物浓度过高

· 样本浓度过高

· 终止液中硫酸浓度过高或变质可能会发生炭化反应

注：酶结合物是指酶与抗原或抗体结合的复合物，如酶标一抗、酶标二抗、酶标蛋白等。