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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)品牌商
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北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)
入驻年限：17 年
- 联系人：
客服部
- 所在地区：
北京
- 业务范围：
技术服务、试剂、抗体、细胞库 / 细胞培养、ELISA 试剂盒
- 经营模式：
生产厂商
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公司新闻/正文
「ELISA问诊室」白板、花板、标曲乱跳、CV大？统统靠边站！
13 人阅读发布时间：2026-03-25 14:09
上文我们介绍了ELISA的类型，这次我们来聊一聊ELISA实验中常见的问题及解决方案。ELISA整个操作步骤比较简单明了，包被、封闭、加样、孵育、显色、终止，中间穿插洗板。但是影响实验结果的因素较多，比如试剂盒质量、抗体特异性、抗原浓度等。
ELISA同属“细节决定成败”的实验类型，知晓操作中的常见问题和有效避坑策略，能够达到事半功倍的效果，早日发文章、“结正果”。
一、无信号或信号低
分为多种情况，比如显色反应后样品和标准品都没有信号，整个板无显示反应，即俗称的“白板”。又或者仅样品或标准品无信号。
1、白板：样品和标准品均无信号
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可能原因 |
避坑指南 |
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试剂失效，不同试剂盒混用 |
开始实验前仔细查看试剂盒保质期，确保试剂保存条件正确，严禁试剂盒混用 |
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洗板过度，次数过多或冲击力大 |
核对洗板次数。检查洗板机参数设置是否正确。手工洗板要注意控制力度，枪头悬空，不可碰到孔底，减少对孔底的冲击力度 |
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板孔过干 |
洗板拍板后应尽快加入相应试剂，孵育时覆盖封板膜 |
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孵育不充分 |
校对孵育箱温度。选择合适的孵育温度和时间，比如样品37℃孵育1-2小时，二抗室温孵育1-2小时等 |
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检测抗体浓度太低 |
严格按照说明书进行稀释，可进行梯度稀释摸索最佳的抗体浓度 |
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试剂中含有EDTA、NaN3等 |
使用洁净的容器和去离子水配制溶液 |
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试剂未平衡到室温 |
提前室温平衡半小时以上才可开始操作 |
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底物、显色液等试剂浓度低或失效 |
核对试剂配制记录和有效期 |
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读板波长不正确 |
核对波长是否正确，确保酶标仪状态及波长 |
2、仅样品无信号或信号值低
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可能原因 |
避坑指南 |
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样本中待测物浓度太低 |
测定样本中蛋白浓度，降低稀释倍数或浓缩样本。选择灵敏度更高的ELISA，如直接法换成间接法 |
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样品类型不相容 |
设置阳性对照 |
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样品反复冻融降解 |
样品要及时分装保存，避免反复冻融 |
3、仅标准品无信号或信号值低
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可能原因 |
避坑指南 |
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标准品失效 |
确认标准品有效期。标准品一般分装后在-80℃保存，避免反复冻融。 |
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标准品复溶不当 |
复溶前短暂离心，核对复溶稀释液的配制记录 |
二、背景高
“花板”是一种ELISA背景高的体现，酶标板反应孔颜色分布不均匀，或者空白、阴性、阳性对照结果正常而样本孔OD值偏高。背景高解决关键在洗板。
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可能原因 |
避坑指南 |
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洗板次数少，不充分 |
增加洗板次数，延长浸泡时间，洗板及加样前确保弃去残留溶液 |
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样品浓度较高 |
用BCA法或Bradford法测定样本的蛋白浓度，通过梯度稀释确定最佳的反应浓度 |
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邻近孔交叉污染 |
洗涤液不可溢出孔。垂直拍板，吸水纸使用滤纸，避免孔内进入纸屑残渣。每次拍板在不同的位置或更换吸水纸。孵育时封闭要严密，防止阳性样本蒸发产生周边现象 |
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加样时忘记更换枪头或者枪头污染 |
吸取不同溶液要及时更换枪头 |
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孵育温度过高或时间过长，产生非特异结合 |
校对孵育箱温度。进行预实验，选择合适的孵育温度和时间 |
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血液类样品发生溶血、凝聚不充分、发生细菌污染 |
红细胞溶解会释放过氧化物，在收集和处理血液样品时要轻柔处理。样品在超净台处理，避免染菌 |
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封闭不彻底 |
提高封闭液浓度或更换新鲜配制的封闭液，37℃封闭1-2小时 |
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显色不当 |
显色要避光，控制显色时间，及时终止反应 |
三、标曲乱跳
标准品进行倍比稀释后的OD值没有梯度，或标准曲线最高点吸光度偏高、偏低。有时在标曲正常的情况下还会存在样品无信号或信号弱的情况。
1、标曲最高点OD值太高（＞3.0）
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可能原因 |
避坑指南 |
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显色底物TMB孵育时间太长 |
一般孵育时间为15-30min，可通过预实验确定最佳孵育时间，及时加入等体积的终止液（2M H2SO4） |
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指纹、杂质污染 |
双波长检测，去背景 |
2、标曲最高点OD值偏低（＜0.8）
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可能原因 |
避坑指南 |
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显色时间不够 |
在标准品8个稀释样品中（用S1-S7、blank标注），当S1、S2变为深蓝色，且有明显的梯度，S5淡蓝色时，终止显色反应 |
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标准品降解或溶解不充分 |
标准品稀释液现用现配。标准品粉末完全溶解后，按实验需求量进行分装冷冻。 |
3、标曲品OD值无梯度
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可能原因 |
避坑指南 |
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标准品进行下一步稀释前没有混匀 |
轻摇试管混匀，静置1-2min再进行下一个梯度的稀释 |
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孔间交叉污染 |
加样和洗板时操作要标准 |
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孵育时未加盖，溶液挥发或污染 |
使用封板膜或盖盖 |
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不同试剂盒或不同批次的混用 |
商品化试剂盒中各类试剂是有富余的，不需要混用 |
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检测抗体浓度过高，不同浓度的OD值相近 |
按照说明书进行稀释，或进行预实验，选择合适的稀释比例 |
4、梯度稀释时出现跳孔
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可能原因 |
避坑指南 |
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加样错误或梯度稀释不准确 |
除了仔细，别无它法 |
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酶标板叠放 |
轻拿轻放，勿使孔中液体流出，避免叠放 |
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酶标板底有杂物或液珠 |
读数时擦拭干净酶标板底部 |
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洗板操作不当 |
甩掉洗液的翻转动作（从正上方旋转120-150度）要迅速、干脆，避免交叉污染 |
四、变异系数（CV）大
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可能原因 |
避坑指南 |
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孔内有气泡 |
加样时避免产生气泡，读板前确保孔内无气泡 |
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样本不均匀 |
样本混合均匀，无污染。重复同一样品时，加样量和加样时间应相同 |
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移液量不准 |
校准移液器，小心操作 |
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边缘效应 |
使用封板膜防止边缘孔蒸发，孵育过程不叠放酶标板，确保孵育温度均衡 |
除了以上常见问题及解决方案，这些因素对ELISA结果同样重要，需要在操作时格外注意：
1）建议标准品和样本设置2-3个复孔进行检测，通过计算平均值、CV值，提高结果的准确性和精密度，同时解决实验中误操作造成的跳孔问题。
2）在最佳时间终止ELISA反应是成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反应系统中，标准品S1-S3出现明显梯度差异的蓝色，S5出现淡蓝色时，需要终止反应。或者用仪器判断，波长约630nm下，标曲S1孔的OD值达到0.5-0.7，S5孔在0.05-0.08，Blank孔低于0.05时，可终止反应。
3）使用酶标仪在终止反应后的30分钟内进行双波长读数，测定450nm最大吸收波长及630nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为最大吸收波长的减去参考波长的。双波长测定可最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。