0.02 ng/mL就能激活免疫反应！内毒素正在偷走你的实验数据

内毒素是细胞培养过程中不容忽视的问题。细胞培养试剂或介质内毒素过高，会干扰细胞的正常生长和分化，甚至导致实验失败。内毒素通过诱导炎症反应抑制细胞生长或诱导其凋亡。研究发现，低浓度内毒素（< 1ng/mL，1ng≈10EU）可刺激细胞产生细胞因子、激活小鼠巨噬细胞。

内毒素是如何偷偷毁掉你的细胞实验呢？细胞莫名其妙的死亡？干细胞转染效率低至30%？同样的protocol却无法重复出结果？这可能是内毒素在“捣乱”。内毒素隐藏在细胞培养基、添加物、质粒中，难以被发现，却悄无声息的吞噬着实验数据和结果。

 

一、什么是内毒素？

内毒素是革兰阴性菌外膜中独特的结构成分，主要为脂多糖（LPS）。内毒素稳定性强，耐高温、耐酸碱。内毒素难以被发现，且不易去除。微量内毒素（1-5 ng/kg）可引起体温上升，发热反应持续约4小时。在生物制药、干细胞研究中，内毒素因干扰细胞信号和代谢而对细胞产生毒性。特别是无血清培养基，缺乏血清中的天然抗菌成分，更易被内毒素污染。

性质	主要特征
分子结构	单体分子量约10 kDa，在溶液中易形成50-1000 kDa的聚集体。脂质A需与多糖链结合才有活性。
释放方式	细菌死亡后裂解释放，活菌状态下难检出
稳定性	耐高温，灭活需180℃高温下持续3-4h或250℃处理30min
去除方法	常规过滤无效，源头控制很重要

 

二、内毒素对细胞培养的影响

多种细胞易受内毒素影响，如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、肝细胞、血小板、内皮细胞等。极低浓度的内毒素就能干扰细胞正常的生理功能。Schwarz H等人发现0.02-2 ng/mL的脂多糖能激活细胞的免疫反应，且不同细胞对内毒素的敏感度不一样。如THP-1细胞在受到最高浓度LPS（2 ng/mL）刺激时，仅IL-8表达量显著增加，而在相同浓度下，moDCs会大量分泌IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α。人单核细胞和CD1c⁺ DCs对内毒素更敏感，0.2 ng/mL的LPS能够诱导所有细胞因子释放。

低浓度LPS对不同人类免疫细胞细胞因子产生的影响（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

内毒素与细胞膜上的受体结合，激活免疫反应，释放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎性细胞因子，影响细胞生理功能和信号通路紊乱，进而影响细胞生长和代谢，甚至造成细胞凋亡。内毒素提前激活免疫细胞会干扰对细胞因子正常免疫调节功能的研究，出现实验结果偏差。

内毒素过高会造成细胞形态发生明显变化，如体积缩小、折光率降低等。内毒素还抑制细胞的增殖，如G0/G1期延长、S期缩短等会导致细胞生长停滞或凋亡。内毒素在敏感细胞中诱导caspase-3介导的凋亡通路，使原代细胞存活率骤降。内毒素通过磷酸基团与细胞膜上的蛋白质发生反应，或脂肪酸链与细胞膜上的脂质膜和蛋白质亲水区发生作用，改变细胞膜形态，导致细胞功能障碍。

研究人员通过MTT法测定了脂多糖（LPS）对H292和THP-1细胞的毒性作用。结果发现，与未处理的对照组相比，低浓度（1-2.5 μg/mL） LPS处理后，细胞活力未观察到显著变化，表明此浓度下的LPS对细胞无毒性。而高浓度（5-20 μg/mL）的LPS对H292和THP-1细胞具有显著的细胞毒性。

LPS刺激对H292与THP-1细胞活力的影响（源自文献：DOI: 10.3892/mmr.2018.8542）

 

内毒素对细胞功能有显著影响，如影响细胞的基因表达、能量代谢和蛋白质合成。内毒素还会与转染试剂、质粒DNA降低细胞转染效率。

因此，在细胞培养实验中，内毒素影响细胞的生理状态和功能，降低实验的可靠性和可重复性，此外，内毒素的存在可能影响细胞因子和蛋白质的表达控制，细胞信号通路、蛋白质相互作用等研究需要注意内毒素的干扰。对于细胞衍生产品（如疫苗、免疫细胞治疗等）更应关注内毒素污染。

三，细胞培养过程中如何避免内毒素污染

革兰氏阴性菌是细胞培养环境中的常见污染源，细菌死亡裂解或导致内毒素释放。培养基中的血清或蛋白质成分含有较高内毒素也会影响细胞生长。在细胞的传代、冻存等环节操作不当也会导致内毒素污染。细胞培养所有容器和包装材料也会因制造工艺而含有内毒素。

针对内毒素污染的来源，可以通过以下措施控制内毒素：

ü  原料控制：选择低内毒素或超低内毒素的试剂和介质，从源头控制内毒素。

ü  细胞株选择：某些肿瘤细胞株对内毒素敏感度较低可优先选择。

ü  培养环境选择：定期杀菌和在位清洗，减少大肠杆菌污染。优化细胞培养条件，如温度、pH值、渗透压等，以降低内毒素对细胞的不良影响。

ü  质量控制：对所用试剂进行内毒素检测，保证内毒素含量符合标准。

ü  人员培训：确保操作合规，避免人员操作问题引入细菌内毒素。

四、重组蛋白内毒素对细胞培养的影响

重组细胞因子在细胞培养和扩增分化过程中具有重要作用。免疫学实验、细胞凋亡实验、干细胞培养与分化、类器官模型构建等，都需要使用低水平内毒素的细胞因子。细胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平内毒素的重组蛋白是获取可靠实验结果的基础。

为评估重组蛋白中内毒素对细胞的免疫反应，Schwarz H等人构建了对LPS高度敏感的HEK293细胞，将这些细胞分别暴露于不同浓度的重组蛋白（来自两个不同的供应商）和LPS中。结果显示，供应商1的重组蛋白可使NF-kB表达量升高，而供应商2的重组蛋白则未激活NF-kB表达。供应商1重组蛋白诱导NF-kB表达的效果与0.02 ng/mL LPS相近，说明重组蛋白中少量内毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng蛋白）足以激活NF-κB通路。

内毒素对HEK293细胞中NF-kB激活的影响（源自文献：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

 

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义翘神州位于德克萨斯州的生物工程中心（C4B）采用先进的技术和设备生产ProPure™超低内毒素蛋白，内毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），显著优于行业标准（USP <85>：0.5 EU/mg），适用于临床前动物研究、严格的细胞实验与高敏检测分析。同时，C4B还提供超低内毒素蛋白定制服务，满足临床前和药物开发中对内毒素控制的更高标准需求。

超低内毒素蛋白产品列表（热门靶点）

货号	分子	种属	纯度
10440-H17H-B-UE	Alkaline Phosphatase	Human	≥ 95% (SEC-HPLC)
10279-H08H-UE	AXL	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
91085-C02H-UE	CD155/PVR	Cynomolgus	≥ 95% (SEC-HPLC)
10977-H08H-UE	CD3e	Human	≥ 95%
11150-H08H-UE	CD69	Human	≥ 90%
CT081-H2508H-UE	CD79A & CD79B	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
11077-H08H-UE	CEACAM-5/CD66e	Human	≥ 95% (SEC-HPLC)
11996-H08H-UE	c-Kit	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
10694-H08H-UE	EpCAM/TROP1	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
16044-H08H-UE	FGFR3	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
10004-H08H-UE	Her2/ERBB2	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
CT022-M08H-UE	IL12A & IL12B	Mouse	≥ 90%
10369-H01H-UE	IL-13	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)

 

参考文献：

Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840

Xuefang Liu, et al. LPS‑induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542