「伊问翘答」ELISpot实验中斑点不规则、细胞状态对结果的影响有哪些？

酶联免疫斑点（ELISpot）技术可检测具有生物活性细胞分泌抗原的能力，具有高灵敏度和单细胞水平分辨率。ELISpot广泛用于疫苗效价评估、细胞治疗免疫原性评价、药物筛选等免疫学功能检测领域。

然而，在实验操作过程中，您也许会经常遇到斑点形态异常、背景干扰、细胞状态不稳定等问题，这些将直接影响数据的真实性和可重复性。

基于实验操作一线经验，我们采用一问一答的形式，系统梳理了ELISpot实验关键环节的优化方案和问题排查逻辑。本文仅展示斑点异常和细胞状态相关问题，刺激物选择、B/T细胞检测、背景高等细节问题，请查看完整版PDF文档！

斑点异常的根源及优化建议

问：1.如何区分真假斑点？

答：“一个阳性细胞对应一个ELISpot斑点”是ELISpot检测的理论前提。并非所有斑点皆可用于数据统计，符合标准的斑点有其自身特征。标准的斑点呈圆形或近圆形，中心颜色深且致密，边缘颜色逐渐变浅，类似“核晕效应”。ELISpot斑点的直径通常50-150μm，大小不均一，呈正态分布。不同细胞类型、刺激物或分泌物对应的斑点平均直径有所不同，如T细胞产生的斑点较大，单核巨噬细胞产生的斑点较小。

假斑点形状不规则，边缘锐利，颜色深浅不一，无明显的核晕结构。大小差异较大，且分布无规律。细胞膜碎片结合在PVDF膜上，会形成小而非常黑的斑点，这些黑斑点有均匀的强度和锐利的边缘。血清或培养上清中的细胞因子也可能造成非特异性斑点。

问：2.ELISPOT结果中，出现不规则大块斑点或部分区域无斑点的原因是什么？

答：可能的原因如下：

1）细胞重悬不充分，细胞铺板不均匀，导致孔内细胞聚集成团形成大块斑点，其他区域可能会因细胞稀少或无细胞形成空白区。

2）细胞铺板后，在孵育初期晃动板子，导致细胞重新分布、聚集到孔的一侧或边缘。

3）显色底物孵育过久，导致相邻斑点扩散、融合，形成不规则团块。

4）其他操作，如膜局部干燥、孔底存在大气泡。

优化建议：首先确保铺板前细胞悬液混合均匀，可用400目过滤网过滤细胞。加样后勿晃动板子，严格控制显色时间。注意观察阳性对照孔的斑点情况。若对照孔正常，则问题出在样本细胞准备或铺板步骤。若对照孔异常，则问题出在通用试剂或操作流程方面。

问：3.斑点多而小，颜色较浅，可能是哪些原因呢？

答：可能是由以下原因导致：

1）细胞活性或数量问题：细胞活性低，分泌目标蛋白的能力弱，导致形成的斑点小且颜色浅。细胞数量过多，细胞间竞争营养和空间，影响细胞分泌效率，可能使斑点变小变浅。

2）刺激物因素：刺激物浓度过低或特异性不足，无法有效激活细胞，造成细胞分泌目标蛋白量少，进而形成的斑点小而浅。

3）抗体或试剂问题：捕获抗体、检测抗体或酶联物浓度过低，与目标蛋白结合不充分，显色反应弱，斑点颜色浅；抗体特异性差，存在非特异性结合，导致斑点增多但质量不佳。

4）显色操作：显色底物浓度过低或显色时间不足，酶促反应不完全，斑点颜色浅；显色后终止反应不及时，过度显色导致背景升高，相对减弱斑点颜色对比度。

以上因素可能单独或共同作用，需结合实验具体操作和条件进一步排查优化。

问：4.背景过高或无刺激对照组出现斑点，应从哪些方面进行排查和优化？

答：1）试剂：

确保抗体、酶、底物等试剂未过期、未污染。对培养基、缓冲液、检测抗体等试剂进行过滤，去除微粒、微生物等杂质或污染，减少假斑点的产生。

内毒素可非特异性刺激免疫细胞，导致细胞因子分泌增加，影响实验结果的准确性，因此培养基及其中的成分（如血清、添加剂等）应经过内毒素检测，确保内毒素含量低于实验允许的水平（通常要求<1 EU/mL，越低越好）

2）细胞处理：

优化细胞分离与制备：确保细胞分离过程规范，避免细胞损伤、死亡或污染。对于外周血单个核细胞（PBMC）等样本，需严格控制分离条件，保证细胞活性和纯度。

细胞活率检测：实验前检测细胞活率，确保活细胞比例≥90%。死细胞或凋亡细胞可能释放细胞因子或干扰实验，导致背景升高。

细胞静息处理：对于冻存复苏的细胞或可能受到外界刺激的细胞，进行静息处理（如37℃培养箱中静置1-2小时），使细胞恢复到未刺激状态，减少自发分泌。

3）实验操作：

优化洗涤步骤：严格按照实验方案进行洗涤，确保充分去除未结合的试剂、细胞碎片和残留的细胞。洗涤次数不足可能导致背景升高，但过度洗涤也可能影响斑点质量。

控制孵育条件：确保孵育温度、时间和气体环境（如CO₂浓度）符合实验要求。温度波动、孵育时间过长或过短都可能影响细胞活性和分泌，导致背景异常。

问：5.如何判读斑点才能减少ELISpot结果误差？

答：建议采用专用读板仪（如CTL、AID）自动拍照，通过预设软件参数（斑点大小、强度、对比度）自动识别和计数。自动化计数后必须人工检查图像，排除杂质、膜破损、边缘效应等形成的假斑点，拆分因细胞聚集或显色过度形成的融合斑点，确认软件是否漏记弱斑点或误计背景。

关键参数：必须根据阳性对照、阴性对照、背景对照精准设定分析阈值，以区分真假斑点和背景信号。

细胞制备的关键质量控制

问：1.怎样状态的细胞适合做ELISpot实验？

答：1）高活率：细胞活率是关键指标，一般要求活率≥90%，最低不应低于80%。高活率确保细胞能正常响应刺激并分泌目标蛋白，避免死细胞释放的蛋白或核酸干扰实验结果，导致背景升高或假阳性。

2）功能完整：细胞需保持完整的免疫功能或分泌能力。如T细胞应能正常识别抗原并分泌细胞因子，B细胞应能分泌抗体。若细胞因冻存、分离或培养条件不当导致功能受损，会影响实验结果的准确性。

3）无污染：细胞样本应避免混入杂蛋白、血清因子、细菌或其他细胞碎片。如外周血样本需去除红细胞、血小板。脾细胞需避免脂肪组织残留，确保实验体系纯净。

4）均匀分散：细胞应呈单细胞悬液状态，避免细胞团聚。ELISpot实验需细胞均匀分布在板孔底部，以便准确捕获单个细胞分泌的蛋白。

问：2.采用什么方法分离PBMC？

答：在采血时不要选择EDTA作为抗凝剂，可选择肝素或柠檬酸钠。EDTA会螯合钙离子影响细胞因子的分泌。采集的全血在实验操作前应置于室温，不要冷藏。血液要及时分离，最好能在采血后两个小时之内做淋巴细胞分离，这样既能保证分离效果，也能保证分离所得细胞的状态。一般采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。

问：3.在ELISpot检测中，新鲜分离的PBMC和冻存的有哪些差别？

答：主要在细胞活力、亚细胞组成、基因表达、实验结果稳定性方面存在差异，具体如下表：

综上，新鲜PBMC是ELISpot检测的样本，能提供更准确、稳定的结果。若需使用冻存PBMC，需优化冻存和复苏流程，并通过静置处理恢复细胞活性，以减少对实验结果的影响。

问：4.冻存的细胞能用于ELISpot实验吗？

答：如上，新鲜和冻存的PBMC都可用于ELISpot分析。但是对于T细胞功能分析，建议使用新鲜的啮齿动物脾脏细胞进行测定，因为该细胞的冷冻保存过程较为复杂，并且冷冻保存对脾细胞活力和功能有负面影响。

问：5.除了免疫细胞，ELISpot实验可以用于检测其他细胞吗？

答：理论上，ELISpot可以检测任何分泌蛋白质的细胞类型，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。尽管目前，ELISpot主要用于悬浮细胞实验，但贴壁细胞也有相关的案例。常见的样本类型有人外周血、小鼠/大鼠脾脏、培养的细胞系（贴壁细胞/悬浮细胞）、黏膜组织或其他组织。

问：6.检测T细胞免疫，用小鼠脾细胞好呢还是PBMC？

答：建议使用新鲜提取的脾脏淋巴细胞。原因很简单：小鼠血量少，采血分离PBMC的得率低，不够做T细胞功能检测。提取脾细胞后立即用预温的完全培养基重悬，然后尽快铺板刺激，切勿冷藏或长时间放置。

问：7.对于普通的不加CAR的T细胞或基因编辑T细胞，常用肿瘤抗原多肽进行刺激，而在生理上刺激T细胞的是负载抗原的DC细胞，这样是否合理？直接用多肽是否会导致假阴性？

答：选择多肽刺激还是负载抗原的DC细胞刺激，主要取决于您的实验目的、CAR的特异性、抗原表达形式以及所关注的免疫反应类型。

1）明确CAR的识别特性：

如果您的CAR是针对已知线性表位（如某些病毒抗原或突变肽）设计的，多肽刺激是直接、高效的选择。如果您的CAR是针对完整的膜蛋白或构象依赖性表位（如针对GPC3、CD19等），使用负载全长蛋白或表达该蛋白的DC能更好地模拟生理状态，评估CAR的功能。

2）考虑实验目的：

如果实验目的是功能验证与效价测定，仅需快速检测CAR-T是否被激活并分泌效应细胞因子（如IFN-γ），多肽刺激通常足够，且更易于量化。如果实验目的是机制研究与更全面的功能评估，包括对天然抗原的识别、持久性、杀伤协同作用等，负载抗原的DC或直接使用靶标阳性肿瘤细胞作为刺激物是更好的选择。

ELISpot实验的精密度建立在无数细节之上。从抗凝管的选择到洗涤拍干的力度，每个环节的微扰动都会在PVDF膜上被指数级放大。唯有建立系统性排查思维，将经验性操作转化为参数化控制，方能实现从"做出斑点"到"做出可靠数据"的跨越。