四步决策法+四大表达系统，轻松搞定重组蛋白表达

重组蛋白表达在基础研究、结构研究、药物开发、诊断研发、酶制剂等领域具有重要作用。

 

在进行相关研究或生产时，你是否也会选择困难？大肠杆菌、哺乳动物、昆虫细胞、无细胞系统……究竟哪个表达系统才适合自己的蛋白表达呢？

 

恰当的表达系统，能够应对复杂多样的实验需求，决定蛋白表达的质量和效率，甚至影响整个项目的成败。

 

义翘神州深耕重组蛋白表达18载，每年研发上千种新蛋白，成功交付项目累计超过10W+。我们成功构建四种常用蛋白表达系统，为客户提供从基因合成到蛋白表达纯化的一站式服务。我们致力于用更短的交付周期为您提供更高品质的重组蛋白，实现深度私人定制，帮助您最大限度的提高项目成功率。

 

四步决策法：轻松选择重组蛋白表达系统

是时候对盲目试错说不了！

基于对欧洲蛋白质生产及纯化合作组织60位科学家的调查结果，STAR Protocols发表了一份重组蛋白生产选择合适表达系统的简明指南，概括为“四步决策法”。

 

第一步：选择表达系统类别

主要依据目的蛋白的基本信息，比如氨基酸序列（是否存在信号肽、跨膜结构域、糖基化位点、半胱氨酸位点等）、二硫键数量、分子量大小、蛋白结构（单域、多域、复合体）、有无辅因子、必需的翻译后修饰（PTMs）等。原核蛋白优先选择大肠杆菌表达系统。结构复杂、分子量大、需要进一步修饰的蛋白建议选择真核表达系统。等电点极端、易聚集的蛋白，在原核系统中更易形成包涵体，建议尝试酵母、昆虫或哺乳动物系统。

 

第二步：根据蛋白关键特征缩小范围

3个关键特征将决定是继续用大肠杆菌还是转成真核系统。

 

关键指标	界定范围
二硫键数量	≤3个	且无需PTMs，可选大肠杆菌
	＞4个	直接排除原核，选择真核系统
分子量	≤100kDa	单细胞/复合物，可选大肠杆菌
	＞100kDa	真核系统更靠谱
膜蛋白复杂度	小型整合膜蛋白	可尝试大肠杆菌
	复杂膜蛋白	如GPCR、离子通道，直接选择昆虫细胞或哺乳动物细胞

 

第三步：真核系统“哪家强”

真核系统之间的主要差别体现在糖基化类型、蛋白折叠准确性、分泌及分泌路径等方面。哺乳动物细胞能够实现真实的糖基化、正确的蛋白折叠及PTMs，蛋白表达水平和活性高，且高效稳定，免疫原性低，适用于表达复杂的蛋白质，特别是药物生产领域。表达的蛋白可以分泌至培养基，纯化工艺简单。哺乳动物细胞主要采用HEK293和CHO。酵母系统不适合糖基化蛋白的表达。

 

第四步：结合生产需求确定最终方案

如果蛋白表达是为了快速验证，短期少量需求，可以选择瞬时表达系统。如果是持续使用、长期大量生产，需要投入时间构建稳定细胞系，如哺乳动物或昆虫-杆状病毒系统。

不同系统的表达效率、周期和成本差异如下表：

表达系统	表达时间	表达量	成本
大肠杆菌	1-2天	高	低
酵母（毕赤酵母）	2-4天	较高	中等
昆虫细胞（Sf9）	5-7天	中等	中等
哺乳动物（CHO）	数周（稳定株）	中等	高
无细胞	数小时	高	高

 

注：成本包含培养基、试剂、设备、人工、纯化过程等

 

“四步决策法”基本可以确定目的蛋白适配的表达系统，但其他一些关键性特征也需要考虑。

目的蛋白的定位不同，对表达系统的要求也不同。结构简单的胞内蛋白，可选用效率高的大肠杆菌系统。结构复杂、折叠要求高的跨膜蛋白或膜受体，推荐用昆虫或哺乳动物细胞表达。需要在胞外分泌表达的蛋白，选用哺乳动物细胞系统更高效。

目的蛋白的用途也是需要考虑的因素。常规实验室研究，选择低成本的大肠杆菌或者高效率的哺乳动物瞬转表达系统。结构生物学通常要求蛋白折叠良好、均一、尽可能接近天然结构，蛋白功能研究需要确保PTMs、辅因子正确，抗体、疫苗、治疗性蛋白等对免疫原性、人源化修饰、糖基化要求严格，推荐选用哺乳动物表达系统。高通量蛋白表达、AI从头设计蛋白验证追求“速度”，因此无细胞表达系统具有独特的优势。

同时还应考虑实验室或企业是否具备相应系统的设施和经验，比如是否有哺乳动物瞬转或稳定表达的经验？是否有杆状病毒载体系统？是否有配套的无血清培养基？义翘神州深耕重组蛋白表达18载，拥有成熟的哺乳动物、杆状病毒-昆虫、大肠杆菌、无细胞四大表达系统。义翘神州通过不断优化创新，使各系统表达量获得提升，比如最快10天就可以交付哺乳动物表达蛋白。

 

四大系统：轻松解决重组蛋白表达难题

 

蛋白表达系统不仅是实验室工具，更是现代医学的“分子药厂”。表达系统已从单一的原核细胞发展成涵盖原核、真核乃至无细胞的多维技术空间。目前，全球70%的重磅生物药通过重组蛋白表达制备，覆盖癌症、自身免疫性疾病、传染病等。

 

一、大肠杆菌表达系统：经济实惠的选择

近半世纪以来，大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）一直是蛋白质重组表达的主要宿主，是目前应用最广泛、经济最实惠的系统之一。BL21（DE3）是广受欢迎的大肠杆菌菌株，含有编码T7 RNA聚合酶的基因，允许IPTG调控的T7启动子驱动下的基因表达。

 

大肠杆菌表达系统具有以下优势：

遗传背景清楚：利于密码子和表达载体优化，以及诱导表达条件优化

细胞增殖快：20分钟内完成细胞分裂，实现快速增殖

表达量高：高效合成，高水平重组

成本低：培养基简单，工艺流程稳定

适用范围：细胞因子、原核蛋白等不需要复杂翻译后修饰的蛋白或小分子量蛋白，同时也是研究新型药物的重要平台。

 

二、哺乳动物表达系统：更接近天然蛋白

哺乳动物细胞提供与原生环境相似的细胞环境和翻译后修饰，表达的蛋白质在结构和活性上更接近天然蛋白，适合表达生产分子量较大或更复杂的真核蛋白质。

常用的细胞系源自人胚肾293（HEK293）或中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。HEK293易于转染，常用于研究应用，而CHO细胞稳定，多用于工业大规模生产。悬浮培养的HEK293细胞也可用于蛋白质大规模表达，常用的细胞系有HEK293-6E、HEK293F和Expi293F。悬浮培养需要商业化的无血清细胞培养基。

 

哺乳动物细胞表达系统特征：

翻译后修饰：重组蛋白结构、修饰方式几乎与天然蛋白相同，生物活性高

表达水平：低于E. coli，可通过优化细胞系和载体提高产量

成本：相对较高，技术要求高

适用范围：表达分泌蛋白、跨膜蛋白、酶类、离子通道等具有复杂PTMs的蛋白质。

 

三、昆虫细胞表达系统：杆状病毒的巧妙应用

与哺乳动物细胞类似，昆虫细胞也可以进行蛋白质翻译后修饰及蛋白折叠。SF9、SF21等昆虫细胞系易于大规模生产。昆虫细胞瞬时表达可在一周内完成，适合快速验证。昆虫细胞已广泛用于膜蛋白、多亚基复合物和病毒样颗粒蛋白的生产制备。

昆虫细胞系统以杆状病毒介导为主。杆状病毒基因组允许插入100kb的外源遗传物质，实现了单个或多个基因的表达。Polyhedron启动子在病毒复制周期的后期活跃，允许有毒基因表达，对细胞损害小。且杆状病毒只感染昆虫，对人类没有致病性，安全系数高。

杆状病毒-昆虫细胞系统具有：

 

翻译后修饰：蛋白正确折叠、二硫键搭配完全，生物活性高

表达量高：外源基因表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%

安全性：对脊椎动物安全

适用范围：毒性蛋白、激酶、病毒蛋白等。

 

四、无细胞蛋白表达系统：AI设计的超级加速器

 

无细胞蛋白表达系统合成速度更快，所需设备更加简单，操作更便捷，可合成对宿主有毒性的蛋白或引入非天然氨基酸对蛋白选择性修饰。适用于高通量蛋白筛选、新型靶点药物开发、个性化疫苗定制、酶制剂生产等。

 

AI蛋白预测、从头设计蛋白，全新设计的人工蛋白开始在药物研发、工业催化中崭露头角。但研究人员常常被一个问题卡住：如何快速验证AI设计蛋白的真正功能？

 

传统蛋白表达系统（如E. coli）需要将AI设计的基因片段克隆到载体，转化到感受态细胞，挑单克隆、摇菌扩增培养，至少需要2-3天的时间，再加上蛋白纯化、验证，大概需要4-5天时间。而且一些毒性蛋白、膜蛋白难以直接表达。设想一次验证数百个AI设计的候选蛋白，需要多大的工作量呢？中间还可能出现污染、表达不稳定等一系列问题。这就凸显出无细胞蛋白表达系统的优势了。

 

无细胞系统让重组蛋白表达进入Hours时代，不需要细胞克隆，直接加模板就能完成蛋白合成。PCR产物、DNA或mRNA加入无细胞反应体系，数小时即可检测到蛋白。很多从头设计的蛋白会被活细胞视为“异物”被降解，或对细胞产生毒性，导致表达失败，而无细胞系统没有这些“防御机制”，不仅能合成对活细胞有毒的蛋白，还可以通过调整反应条件，使难折叠的人工蛋白形成正确的结构。无细胞系统还能一次实验验证上百个候选序列，“天生”适配高通量筛选。

 

最后划重点

没有“完美”的表达系统，关键是让目的蛋白特性、生产需求、后续应用与系统匹配度更高，同时考虑拥有的专业技术和设备。请收藏这份策略指南，下次选蛋白表达系统不用再纠结！

 

义翘神州重组蛋白表达系统

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【参考文献】

1. Anja Schütz, et al. A concise guide to choosing suitable gene expression systems for recombinant protein production. STAR Protocols, 2023.