ADC药物研发加速器：pH敏感探针如何破解抗体内化难题？

引言

ADC作为靶向肿瘤治疗的重要领域发展迅速。截止到2025年7月，全球已有19款ADC药物获批上市（FDA获批15款）。ADC效果主要依赖于抗体的特异性靶向能力、内化效率及毒素载荷的释放。因此，在ADC开发过程中，评估抗体内化效率及抗体-毒素复合物的细胞毒性至关重要。

 

为满足这一研发需求，我们隆重推出基于pH敏感的抗体标记试剂，专为ADC抗体内化检测设计。义翘神州抗体内化检测试剂（货号：SSL001）可用于ADC抗体开发、药物优化、临床前开发、作用机制研究等方面，具有以下突出优势：

· 信噪比高：阳性信号强，背景值低
· 操作方便：37℃仅需15min完成抗体标记
· 应用广泛：不同细胞、克隆的ADC抗体筛选
· 兼容性强：可用于流式细胞、荧光显微镜、高内涵成像、荧光读板仪等
· 不影响抗体效力：特异性结合抗体Fc端，不影响抗原结合

 

01 ADC药物的核心机制：内吞作用

抗体内化即抗体内吞，是细胞表面的抗体结合抗原后，通过自身分子运输体系将复合物带入细胞内部的过程。大多数ADC药物分子通过抗体内化进入细胞，形成早期内体。早期内体被转运至晚期内体和溶酶体，然后被酶解或化学裂解释放出细胞毒性药物，导致肿瘤细胞死亡或凋亡。

ADC内化过程示意图（源自文献：doi: 10.1038/s41392-022-00947-7）

抗体只有与特定的靶抗原结合才能被内化，而内化的效率受到多种因素影响，包括抗体自身因素和靶细胞状态。

抗体亲和力越高，抗原结合越有效，特异性高避免非特异性干扰结合，有利于提高抗体内化效率。抗体的不同类型和亚型也会影响内化效率，比如IgG和IgA的内化速度比IgM和IgE快。虽然高浓度的抗体有利于抗体内化，但可能导致受体饱和，反而降低内化效果。相比较而言，B细胞和巨噬细胞的内化能力要比T细胞、红细胞强。

因此，在ADC研发过程中，筛选出内化效率高的抗体是至关重要的。抗体内化检测不仅是药物筛选的关键步骤，更是机制优化的核心手段。将内化数据量化，我们可以精准预测ADC的药物动力学，还能为临床试验提供关键数据支持。

 

02 pH-Red抗体标记染料：ADC内化评估的利器

（1）基于活细胞成像的内化检测

基于活细胞成像的内化检测是通过实时活细胞成像仪对裸抗进行药效动力学检测。比如IncuCyte®系统可以固定的时间间隔拍摄细胞图像，计算内化的细胞数量、速率等参数，可实时检测72小时。还可以结合pH-Red敏感试剂动态监测ADC抗体在肿瘤细胞中的内化过程，为ADC内化研究提供特异性、高通量的解决方案，显著提高研发效率。

（2）基于毒素偶联的内化检测
基于毒素偶联的内化检测主要有两种：DT-3C和Mab-ZAP，都是通过抗体-毒素复合物在细胞内的释放引发细胞毒性，通过检测细胞杀伤来评估抗体内化效果。DT-3C是白喉毒素（DT）的毒素部分Fragment A与链球菌蛋白G的3C片段融合而成的重组蛋白。DT-3C与抗体Fc端高度亲和。结合DC-3C的抗体被内吞进入细胞，并在酶的作用下释放DT，进而杀死细胞。而未进入细胞的DT-3C不具有杀伤细胞的活性，据此评估ADC内化效率。同样，Mab-ZAP带有毒素ZAP，抗体内化后被释放。

（3）基于温度转变的荧光二抗内化检测
基于温度转变的二抗检测内化是利用荧光二抗在不同温度下的荧光强度变化，如4℃进和37℃。通过检测和分析荧光信号的变化评估抗体内化速率。

（4）基于pH敏感探针的抗体内化检测
基于pH敏感标记检测内化操作更简单。利用荧光染料对pH值的敏感度，在细胞外时处于中性（pH 7.4），几乎不会产生荧光。当抗体内化到核内体（Endosome）或溶酶体（Lysosome）中，处于酸性环境（pH 4.7-5.5），荧光素可被激发产生明亮的红色荧光信号（640/655 nm）。通过荧光显微镜或流式细胞仪来测量荧光信号的强弱，可以评估抗体的内化程度。

pH敏感抗体标记试剂可与多种主流分析平台兼容，如流式细胞术、荧光显微镜、细胞成像系统等，用于ADC药物开发的不同阶段，比如：

· 在抗体发现阶段，pH-Red抗体标记试剂结合流式细胞术，高通量快速筛选高特异性和高效内化的抗体，定量分析内化效率，确保候选靶点的有效性。

· 在工艺开发阶段，pH-Red抗体标记试剂能够用于精准量化ADC药物递送效率，为产品的稳定性和可靠性提供数据支撑。

· 在临床前开发阶段，基于pH-Red抗体标记试剂的流式细胞术、荧光显微镜、细胞成像系统等多平台联合检测，可以全面评估ADC的内化效率、稳定性及细胞毒性，提高药物开发成功率。

 

03 义翘神州pH-Red抗体内化检测试剂
为了助力ADC药物复杂的研发过程，义翘神州基于作用机制开发了高效的pH敏感的抗体内化检测试剂，简便、快速、精准。抗体内化检测试剂可用于抗体发现、抗体优化、工艺开发、临床前检测等多个ADC研发过程。

适于多种抗体亚型的内化效率检测

Internalization assay using SwiftStain™ Human pH-red Antibody Labeling Dye (Cat#: SSL001)-labeled antibodies and antigen-expressing cells.Her2+ SK-BR-3 cells (Fig. A) and CD33+ THP-1 cells (Fig. B) were incubated with Trastuzumab ( IgG1 ) or Gemtuzumab ( IgG4 ) conjugated to the dye, or with the Dye alone, at 37ºC, 5% CO₂ for 17 hours, washed three times with 1x PBS, and then analyzed by flow cytometry.

卓越的信噪比，信号强背景低

Internalization assay using SwiftStain™ Human pH-red Antibody Labeling Dye (Cat#: SSL001)-labeled antibodies and antigen-expressing cells.Her2+ SK-BR-3 cells (Fig. A) and CD33+ THP-1 cells (Fig. B) were incubated with Trastuzumab ( IgG1 ) or Gemtuzumab ( IgG4 ) conjugated to the dye, or with the Dye alone, at 37ºC, 5% CO₂ for 17 hours, washed three times with 1x PBS, and then analyzed by flow cytometry.

 

【参考文献】

1. Zhiwen Fu, et al. Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2022. doi: 10.1038/s41392-022-00947-7

2. Hammood, M. et al. Impact of EndocytosisMechanisms for the ReceptorsTargeted by the Currently ApprovedADCs—A Necessity for Future ADCResearch and Development.Pharmaceuticals 2021. doi: 10.3390/ph14070674