蛋白磷酸化研究和选对抗体究竟是什么关系？

磷酸化研究

对于“磷酸化”，大家耳熟能详。
对于磷酸化蛋白检测，大家“苦不堪言”。
即便我们做到了“快、准、冷”，但还是难免检测不到信号。面对一次次的失败，我们脑海中难免会出现一个大大的问号：

如何提高磷酸化蛋白检测的成功率？

本文将以EGFR磷酸化抗体为例，从抗体特异性、灵敏度、磷酸化位点等方面，简述磷酸化蛋白检测的重点。

 

磷酸化抗体特异性

磷酸化抗体能够识别蛋白特定位点是否发生磷酸化，用于检测蛋白质的磷酸化水平。并且只能识别磷酸化的蛋白，不能识别非磷酸化的蛋白。义翘神州的一系列EGFR磷酸化抗体具有特异性，以Phospho-EGFR (Tyr1068) 抗体（货号：110463-R0027）为例，WB检测结果显示，用10 ng/mL的EGF（货号：10605-HNAE）处理血清饥饿的Hela细胞提取物30分钟，磷酸化EGFR抗体条带清晰显示，而未经EGF处理的细胞无磷酸化抗体条带。

图片源自义翘神州官网

EGFR磷酸化激活

EGFR属于细胞膜表面酪氨酸激酶受体。EGFR是单次跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜区、胞内域。胞外域能够与多种配体结合，如EGF、TGF-α、HBEGF、双向调节蛋白（AR）、表皮调节素（EPR）等。跨膜区由23个疏水氨基酸组成。胞内域由激酶结构域及多个磷酸化位点组成。

EGFR激活机制（图片源自A. Conte and S. Sigismund, doi: 10.1016/bs.pmbts.2016.03.002）

当配体（如EGF或TNF-α）结合到胞外连接位点，EGFR激酶结构域形成一个同源二聚体或异源二聚体。在二聚化构象中，EGFR酪氨酸激酶区域在ATP存在下磷酸化，并触发细胞质调节域中特定酪氨酸残基的磷酸化，从而激活下游信号通路。活化的EGFR可将增殖信号和抗凋亡信号通过PI3K-AKT-mTOR、Ras-Raf-MEK-ERK1/2等多个下游信号传导途径，传递至细胞核，控制细胞生长和分裂等。

EGFR中有9个酪氨酸残基可在配体结合时磷酸化，并可作为含SH2和PTB结构域蛋白的结合位点。这些酪氨酸残基中有7个已被证明与信号效应活性有关。

EGFR C端磷酸化位点及其与信号效应器的相互作用（图片源自A. Conte and S. Sigismund, doi: 10.1016/bs.pmbts.2016.03.002）

 

磷酸化抗体灵敏度

蛋白质磷酸化是蛋白质重要的修饰机制，细胞中约1/3的蛋白质会发生磷酸化，涉及细胞转导、神经活动、肌肉收缩及细胞增殖、发育和分化等。

磷酸化蛋白的丰度较低，可能仅占细胞总蛋白的一小部分，大概只有总蛋白的10%左右。并且磷酸化蛋白还存在快速的去磷酸化难题。

因此蛋白检测需要高灵敏度的磷酸化抗体，如义翘神州EGFR磷酸化抗体稀释20万倍，WB检测结果仍有清晰的条带。

不同稀释倍数Phospho-EGFR（Tyr1068）抗体（货号：110463-R0027）的WB检测结果。样品为10ng/mL EGF处理的30分钟的血清饥饿Hela细胞，抗体稀释倍数为1:2000、1:20000、1:200000。（图片来自义翘神州）

 

合适的反应时间

一般情况下，样品中蛋白质磷酸化水平较低，甚至不表达，因此需要通过物理或化学方法进行诱导或刺激。不同靶点刺激的时间和强度不同，需要查找文献或进行预实验。注意，刺激需要做到充分但不过量。刺激过久可能会进入负反馈机制，造成检测结果下降。

义翘神州用10ng/mL EGF处理血清饥饿Hela细胞，刺激时间分别为2、5、10、20、30、60、120分钟，检测EGFR 845位酪氨酸磷酸化。结果如下，刺激10-20分钟效果最佳，超过30分钟基本检测不到条带。

图片来自义翘神州

 

磷酸化位点要选对

磷酸化抗体是针对磷酸化位点制备的，不同位点需要对应的抗体进行检测。如EGFR中有9个酪氨酸残基可在配体结合时磷酸化，Y1148、Y1173、Y1068等。

这些位点识别结合不同的信号效应器。磷酸化的Y992、Y1148、Y1173识别结合SHC，磷酸化的Y1068、Y1086结合GRB2。因此在选择磷酸化抗体之前，一定要先查阅文献或者根据磷酸激酶来判断可能的磷酸化位点。

不同磷酸化位点的EGFR抗体
货号	磷酸化位点	抗体类型
110828-R0007	Tyr845	Rabbit MAb
110844-R0002	Tyr1173	Rabbit MAb
110842-R0004	Tyr1148	Rabbit MAb
110463-R0027	Tyr1068	Rabbit MAb
110840-R0002	Tyr1045	Rabbit MAb

 

【参考文献】

1，Conte, A., & Sigismund, S. (2016). Chapter Six - The Ubiquitin Network in the Control of EGFR Endocytosis and Signaling. Prog Mol Biol Transl Sci,  https://doi.org/10.1016/bs.pmbts.2016.03.002 
2，Lemmon, M. A. (2009). Ligand-induced ErbB receptor dimerization. Exp Cell Res, https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2008.10.024 
3，Zeng, F., Singh, A. B., & Harris, R. C. (2009). The role of the EGF family of ligands and receptors in renal development, physiology and pathophysiology. Exp Cell Res,  https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2008.08.005