免疫组化中抗原修复的方法选择

 
免疫组化中，组织在福尔马林或者其他固定液的固定过程中，经常会出现蛋白质交联而引起的抗原决定簇封闭，极大的降低抗原的检出率和假阴性现象。此外，临床病理诊断中，免疫组化的应用广泛，因此抗原修复成为了免疫组化极其重要的一环。不同的抗原，采取不同的适宜的抗原修复方法，才能获得的清晰、有效的结果。一般情况下，抗原修复的方法主要有三大类：高温高压修复法、微波加热修复法、酶消化法。那我们又该以何种方法来选择呢？

提示：

1. 抗原修复的强度排序：高温高压修复法（准确度高，条件稳定适合大规模处理，易脱片）> 微波加热修复法（反应强度适中，微波加热不均匀不适宜大规模处理）> 酶消化法；
2. 抗原修复方法应用广度：微波加热修复法（实验室常用）>高温高压修复法（医院常用）> 酶消化法（针对一些特殊组织和靶点效果独特，应用不太广泛）;
3. 修复液的效果对比：EDTA（pH=8.0 或 9.0）缓冲液 > 柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）

 

一、细胞质抗原修复

绝大多数细胞质抗原不做任何修复，一般也能获得相对稳定的染色结果。但采取一些抗原修复方法，可以是抗原决定簇释放的更加充分，进一步提高结果的可靠性和敏感性。所以我们一般采取的是强度适中，反应相对温和的抗原修复方法。推荐使用微波修复法（加热的时间和温度都可以有所调整，可以根据经验或者查阅文献获得）

推荐的方法：微波加热修复法

推荐的修复液：常用柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）

实验过程：微波高温加热 2 min（见微小波动，温度在 90～95 ℃）后，立即转为保温 8 min 待缓慢降至室温，用蒸馏水冲洗 2 次，加入 3% H₂O₂ 8 ~10 min，在用蒸馏水冲洗 2 次，放入 PBS 中并进入下一步骤。（提示：在实际的修复试验中，我们还要控制好修复时间，时间过长容易导致过修复、组织破坏和非特异性反应增强等不利影响）
 

二、细胞膜抗原修复

绝大多数细胞膜抗原如果不做任何修复，它的显色结果相对于细胞质抗原要微弱一些。主要是因为他的位置靠外，容易和固定液的甲醛发生交联反应，无论是形成醛键还是羧甲基，都会造成蛋白构象的改变，遮蔽抗原决定簇与抗体连接。所以在细胞膜抗原修复的过程中，这个修复强度要稍微大一些，我们可以选择微波加热或者高压修复（如果微波修复效果不好可以选择）。如果是在实验室做实验，保守的选择微波加热修复，不过，对于时间和温度的控制要稍微加长，温度也可以略微高一些。

推荐的方法：微波加热修复法

推荐的修复液：柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）或 EDTA（pH=8.0 或 9.0），通常EDTA缓冲液的修复效果要优于柠檬酸盐缓冲液，国外很多实验室倾向于应用 DTA（pH=8.0 或 9.0）来修复。

实验过程：微波高温加热 3 min（加热到沸腾，95～100 ℃，一定要保证里面有充足的修复液，防止干片）后，立即转为保温 15 min 待缓慢降至室温，用蒸馏水冲洗 2 次，加入 3% H₂O₂ 8～10 min，在用蒸馏水冲洗 2 次，放入 PBS 中并进入下一步骤。（提示：在实际的修复试验中，我们还要控制好修复时间，时间过长容易导致过修复、组织破坏和非特异性反应增强等不利影响）
 

三、细胞核抗原修复

细胞核抗原处在细胞的最核心位置，它的修复难度要大于细胞质抗原和细胞膜抗原。几乎所有的的细胞核抗原需要应用高压 120 ℃ 热修复才可以达到理想的效果，使用其他方法都很难见到不错的效果。由于高压热修复的强度要大一些，本身容易脱片，所以我们在实验的时候要做好切片的固定，这个有很多方法可以实现，比如烤片的时间控制、添加一些切片的粘合剂等等，大家结合自己的实验来安排。关于修复液的选择，如果目的抗原真的很难修复，可以选择 pH=8.0 或 9.0 的 EDTA 缓冲液。有文献描述说pH的大小与抗原修复效果成正比，这是因为在加热或者液体中的碱性物质可以引起蛋白质分子之间的曼尼希反应，非常容易破坏蛋白质分子的交联。可专门用来针对那些有难度的细胞核抗原的修复，也就是说 EDTA 缓冲液的修复效果要优于柠檬酸盐缓冲液，国外很多实验室也倾向于应用DTA（pH=8.0 或 9.0）来修复（有时间最好两种修复液都做一下，加深感受，有助于提升实验技能）。

推荐的方法：高压热修复法

推荐的修复液：柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）或 EDTA（pH=8.0 或 9.0）

实验过程：高压锅加热到喷气开始再加热 2 min（一定要保证里面有充足的修复液，防止干片）后，立即将高压锅端离火源，一定要等蒸汽排放完成以后，再打开锅盖，待缓慢降至室温，用蒸馏水冲洗 2 次，加入 3% H₂O₂ 8 ~10 min，在用蒸馏水冲洗 2 次，待进入下一步骤。（提示：在实际的修复试验中，我们还要控制好修复时间，时间过长容易导致过修复、组织破坏和非特异性反应增强等不利影响）
 

四、其他特殊类型抗原修复

免疫组化中一些特殊类型的修复，都是一些经验性的总结，比如 CD4/CD8/CD25/CD1a 需先用 3% H₂O₂ 浸泡 8 min，后用蒸馏水冲洗两次，再用高压热修复法进行修复。其染色结果就非常理想，反之阳性信号减少，阳性细胞也变少了。还有一些抗原修复以后反而假阴性大大增加。举个例子 HBcAg 是乙肝病毒的核壳结构蛋白，是 HBV 的核心部分。黄建平等对其进行 3 种抗原修复的方法对比发现，不修复染色最好，高压热修复效果最差。原因是因为甲醛固定的是肝细胞，并没有固定到乙肝病毒上。高温高压的修复，反而导致乙肝病毒的蛋白质变性，极大的影响了染色结果。对于特殊类型抗原的修复，是因为我们对抗原修复的机制研究尚不完全，还有很多问题没有搞清楚。这种方法的积累来源于实验经验的积累和汲取，所以鼓励大家多看看相关类型文献，可以帮助少走弯路。
 
结语

综上所述，抗原修复方法的应用是否得当，直接影响着抗体的表达结果，也影响着最终实验的准确性。不同类型的抗原都有着各自的最佳修复条件，也没有哪一种修复方法是万能的。对于大多数抗原修复我提倡用高压热修复发，这是现有的能最大限度排除假阴性的最好方法。当然了，合理的选择抗原修复方法是需要在实际操作过程中反复摸索、不断完善的。