手把手教你做免疫组化三步法实验（以 SP 法为例）

看到很多人发的帖子，我也想把我掌握的免疫组化方法与大家分享，不一定能做到面面俱到，但是融合了步骤和一些原理性东西给大家当基础知识储备。要是觉得这不错，你就点赞或者收藏。有什么问题也可以留言，我统一整理以后，再以帖子的形式给大家提供我的见解。

一、脱蜡水化：
切片在脱蜡前，放在 APES（防止脱片用的，缺点是有低毒性）1:50 丙酮溶液中浸泡 3 分钟，晾干或 60 ℃ 恒温箱中烘烤 20 分钟，然后将组织切片置于二甲苯中浸泡 10 min，更换二甲苯再浸泡 10 min，无水乙醇浸泡 10 min，更换无水乙醇再浸泡 10 min，然后依次 95% 乙醇，70% 乙醇，50% 的乙醇各 5 min，最后用蒸馏水浸泡 5 min；

原理：
①二甲苯的作用：溶解蜡块，起到脱蜡的作用；
②梯度酒精是为了除去对人体有害的二甲苯，但高浓度的酒精时间过长会导致组织细胞变形，影响抗原的表达，也会影响到组织在显微镜下的光学形态，所以用梯度酒精；
③保持玻片在自来水中，直到准备进行抗原修复。任何时候都不应该使玻片干燥，干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色；

技巧：
①观察是否脱蜡完全，因为石蜡是不溶于水的，如果石蜡脱不完全，水流上去会模糊还有滞流感。原则就是彻底、干净、完全的脱去石蜡。

二、清洗：先用用蒸馏水温柔的冲洗一会，更换 PBS 冲洗 5 min，再用 PBS 冲洗 5 min；
注意：冲洗时尽量温柔，可以多冲洗一会；
①可以将玻片放在卧式缸里，在摇床上轻轻晃 3-5 min，重复 2-3 次；

三、抗原修复：（此步骤根据试验需要可增减）
将切片放入盛有 0.01 M 枸橼酸缓冲液（PH=6.0）中置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 92 ℃~98 ℃ 之间并持续 10~15 min 取出容器，室温冷却 30 min；
注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型；

原理：
①枸橼酸缓冲液，是抗原修复液的一种，一部分抗体使用这种修复液修复的效果最好。
②对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须经过抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加抗原检测率。修复的方法有很多种，我采用的是热修复。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
③修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种我们这次实验用的枸橼酸缓冲液，此外还有 EDTA 缓冲液。（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高 pH 的等）。

四、消除内源性过氧化物酶的活性
用 3% H₂O₂ 滴加到切片上，封闭 5-10 min 去除内源性过氧化物酶。PBS 冲洗 2-5 min，冲洗三次。特别说明：在一些过氧化物丰富的组织里面（肝脏、胎盘、血管瘤、急性炎症组织等）3% H₂O₂ 也不能完全消除内源性的过氧化物，改进的方法就是先用 3% H₂O₂ 阻断 10 min，再用 0.5% 的高碘酸溶液阻断 10 min。

五、封闭：用和二抗来源一致的血清在保湿盒中于 37 ℃ 孵育 15-30 min，然后甩去封闭用血清，勿洗；
注意：封闭时间根据具体实验调整；封闭液一般选用 5% BSA 或与二抗来源一致的血清，切记是 BSA，不是 PBS，很多论坛写的是 PBS，太坑了。
①使用血清好还是 BSA 好？
答：第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用 BSA 或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA 和血清没有明显区别。
第二是待检样本中可能会有 Fc 受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本 Fc 受体之间结合。BSA 则无法封闭 Fc 受体。

六、一抗孵育：
滴加适当比例稀释的一抗，将切片放在保湿盒中于 4 ℃ 冰箱中过夜孵育或者温箱 37 ℃ 孵育 1-2 个小时。
小技巧：一抗孵育可以是 4 ℃ 冰箱中过夜孵育，也可以选择 37 ℃ 孵育 1-2 小时。关键就是温度要控制恒定。普遍情况下都选择 4 ℃ 冰箱中过夜孵育，因为它的温度稳比室温要稳定。
注意：适当比例稀释是可以查到的，很多说明书或该公司网站产品详情页都有，实在不行你直接打电话去问公司的技术支持，他们给的建议更适合他们的产品，可别想当然。

七、清洗：过夜后的切片用 PBS 冲洗 2-3次；
注意：一定要单独冲洗，多个片子防止交叉反应造成污染；温柔冲洗，防止切片的脱落

八、二抗孵育：
滴加生物素标记的二抗在保湿盒中于 37 ℃ 孵育 30 分钟。加之前吹干净标本上的水（可以用吸水纸沿着材料周围画圈把水吸干）
注意：其实抗体孵育过程都是一致的目的都是结合，所以一定要保证在一个环境稳定和稳定恒定的条件下进行，你也许会在实验室发现一个大纸条写着实验中，勿动！

九、清洗：切片用 PBS 冲洗 2 min，冲洗 3 次；

十、滴加适当比例稀释的 HRP 标记的亲和素，再 37 ℃ 孵育 20 min；

十一、清洗：用 PBS 冲洗 2 min，冲洗 3 次；

十二、显色：加入显色剂显色，选择 DAB（快速滴入，观察染色情况）根据显微镜下的观察决定终止显色的时间一般都在 3-10 min 左右，最常用 5 min；

十三、自来水冲洗：自来水充分冲洗 10-15 min；

注意：冲洗的时候要注意水流不要太大，缓慢的冲洗。

十四、复染：加一大滴苏木精复染，细胞核蛋白几秒就可以，细胞浆或者细胞膜蛋白需要然 20-30 s，自来水冲洗，再用 PBS 返蓝 5 min。

注意：
①复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关。如果是第一次做，可以请教一下实验室的老师问一下经验，自己在多备两个片子，摸索感受一下。
②若试验目的只是想说明组织中蛋白表达的有无、量的多少和颜色的深浅，那就不需要苏木素复染；若实验目的是想看组织切片蛋白定位在胞核还是胞浆，那就最好苏木素复染；
③复染试剂的选择与显色系统相关联？如果是 AEC 和 DAB 系统，那么显色应该是红色和棕黄色，这样你用苏木素复染核就不会影响阳性细胞的观察，更何况你所检测的抗原位于胞浆中呢。如果你用 BCIP/NBT 系统显色，则显色为紫黑色，此时你复染核就不能用苏木素了，因两者的色泽相似。你可以选用甲基绿溶液复染核，这样核为鲜艳的兰绿色，不容易与 BCIP/NBT 系统相混淆了。
④关于返蓝的选择，我估计大家看到很多不同选择（有水、氨水、PBS、饱和碳酸锂等等）。本质来说，返蓝的原理是苏木素遇碱变蓝色，所以以上这几种都是偏弱碱性的物质。

十五、脱水透明
依次用 50%，70%，95% 酒精各 5 min 浸泡切片，最后用 100% 酒精浸泡 10 min，更换酒精浸泡 10 min，最后用二甲苯浸泡 10 min，更换二甲苯，再浸泡 10 min；
注意：梯度酒精的作用：脱水，以便片子长期保存；二甲苯是为了使片子更加透明；

十六、封片
捞出，用树脂封片，一滴/张，在其上盖上小玻片
封好的组织切片，放入超净台中，打开抽风，冲一段时间，最后把切片放在窗台上凉 2-3 天，就可收起来。
注意：封片用的材料与显色系统相关：DAB 显色的石蜡切片免疫组化封片用中性树脂或者中性快干胶都可以啊，AEC 显色的用水溶性的封片剂就可以，免疫荧光的话需要专门的防脆变的封片剂或者用甘油也行（但是保存时间很短）。

免疫组化是一个经验养成型实验，实验时最好有个贴心的师弟师妹当助手，做实验之前把该用到的东西都悉心准备一下，在脑海中熟悉一下流程。每一个步骤的材料选择都有很多依据，这需要我们经常看看大家分享的经验帖增加基础知识储备，这个对于实验室大牛得养成有很大的帮助，祝您大功告成！