六招助你搞定Western Blot实验

       关键词： WB 免疫印迹
       Western Blot原理：经过电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western Blot是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。


       第一招：蛋白质的样品制备
       蛋白质提取的质量直接决定着WB结果的好坏。可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。
       第二招：SDS-PAGE
       SDS-PAGE凝胶可以购买商业化的也可以自行配制，不论选择哪种，确定合适的凝胶浓度是十分关键的。凝胶的浓度取决于目的蛋白的分子量大小，目的蛋白分子量越大，则凝胶浓度越低。
选择合适的阳性对照： 阳性对照为已经明确表达目的蛋白的细胞或组织提取物，同时电泳，杂交，以确定检测结果的准确性以及判定抗体的有效性。北京义翘神州公司（Sino Biological Inc.）提供大量的细胞裂解液，可用作WB的阳性对照。将处理后的标本直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，通常选择蛋白质分子量Marker（市售有不同大小的预染和非预染蛋白Marker）。 
电泳时间： 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
       第三招：转膜
       杂交膜是WB进行的介质，应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。
转膜时间一般为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。转膜后，通过丽春红染膜、考马斯亮蓝或预染Marker方法检测确定转膜效率。
       第四招：封闭
       为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，常用的封闭试剂有 1-3%的BSA、5%的脱脂奶粉或生物试剂公司的膜封闭液，缓冲液一般选择PBST或者TBST。一般封闭条件为室温孵育1 h或4℃过夜。
封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST或者PBST，其中的Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如5-6次，每次3 min）比长时间少次数的洗膜更有效。
       第五招：抗体孵育
       抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。 杂交过程： 
(1) 封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的Ab1浓度为1 ug/ml，封口，4℃孵育过夜或室温（22-25℃）摇动孵育2 h。
(2)  液洗膜3次x10 min 。
(3) 标记的Ab2（羊抗兔-HRP）室温1 h，洗膜3x10 min。 
       第六招：蛋白检测
       根据标记Ab2的标记物不同，其杂交的结果检测方法也不同，较常用的检测系统有HRP标记 Ab2的增强化学发光(ECL)和DAB检测系统。
1) 辣根过氧化物酶-DAB法： 
① DAB显色液的配制：按照1ml H₂O加显色剂A,B,C各1滴，混匀。
② 显色：将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现明显的棕褐色蛋白显色带 。
③ 终止：用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应。
 2) 辣根过氧化物酶-ECL法： 
增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理，将结果记录下来：
① ECM显色剂配制：按ml H₂O加显色剂A、B各1滴，混匀。
② 在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，1-5 min。用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液，将一透明的玻璃纸盖住抚平，并确定干的表面与胶片接触。 
③ 将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5 min，冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以长到数小时。 冲洗胶片步骤：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。