有抗体却无信号：免疫荧光实验固定、通透和抗原修复如何匹配？

我们是否遇到过这样的情况呢：

 

抗体在Western blot（WB）中能检测到目的条带，说明书也标注了适用于免疫荧光，但实验结果中靶蛋白却是“漆黑一片”？

 

遇到这种情况，我们第一反应是不是想着提高一抗浓度、延长孵育时间或增加曝光呢？

 

如果问题出在样品前期处理步骤呢？继续增加抗体也往往是徒劳无功，甚至可能带来更高背景。

 

免疫荧光染色能否成功，不仅与抗体质量或浓度有关，还与抗原表位是否保留、抗体能否到达结合表位以及被固定剂遮蔽的表位能否重新暴露。样本的固定、通透和抗原修复与之密切相关。

 

一、确认是否属于样本前期处理问题？

 

在对固定剂和通透剂及其操作步骤进行调整前，还需要先排除几个更加基础的问题：

样本中是否表达目的蛋白及其表达量如何？

选择的抗体是否经过IHC或IF验证？

一抗和二抗的宿主及反应种属是否匹配？

荧光染料与显微镜滤光片或激光通道是否匹配？

阳性实验是否有信号？

 

这些基础的问题需要查阅更多的文献，对靶点蛋白的表达情况进行深入了解。尤其是仅经过WB验证的抗体更是要进行IF验证。WB检测的通常是经过高温变性的蛋白，而免疫荧光是检测处于原始结构中的抗原。抗体在不同应用中的结合表位可及性可能完全不同，需要在WB、IHC、IF或免疫沉淀（IP）等具体应用中分别进行验证，很多做到相互替代。建议先通过预实验摸索实验要素。

 

二、固定：既要避免靶蛋白也要避免遮蔽表位

 

固定操作的目的是尽快终止细胞内的反应，维持组织形态及细胞组分结构。固定不足和固定过度都可能造成无信号。固定不足时，可溶性蛋白可能在洗涤和通透过程中被释放，原有亚细胞定位也可能发生改变。固定过度时，醛类固定剂形成过多交联，抗体识别位点被遮蔽，即使抗体进入细胞，也无法与表位结合。

 

理想的固定剂能够完整保存组织和细胞的形态结构、尽可能减少抗原空间构象和免疫活性的改变、稳定维持分子间的相互作用。但是，迄今为止还没有一种固定剂能满足以上要求，包括福尔马林。因此，需要研究人员不断进行反复实验，在维持组织完整性和抗原免疫反应性之间找到精妙的平衡。

 

我们应该使用醛类固定剂呢还是有机溶剂固定剂？

 

根据固定剂的化学作用原理，主要分为交联型（非凝固型）和凝固型两大类。凝固剂的选择会影响抗原修复、抗体孵育及检测信号等。

 

甲醛、PFA及中性缓冲福尔马林属于交联型固定体系，通常能够较好地保存细胞形态、膜结构和可溶性蛋白。对于培养细胞，4%甲醛或PFA室温固定约10～15分钟可作为常见预实验起点，但不能视为适用于所有靶标的统一标准。

 

甲醇和丙酮则通过脱水和蛋白沉淀实现固定，同时具有通透作用。它们可能会暴露部分在天然构象中不易结合的线性表位，因此某些细胞骨架或核内抗原在甲醇固定后信号更好。但有机溶剂会破坏脂质膜、影响细胞器形态，可能导致小分子或部分可溶性成分丢失。对于需要保留GFP等荧光蛋白自身荧光的实验，需要谨慎使用。

 

荧光结果	优先考虑来源
血管壁、纤维束或基质联系发亮	胶原、弹性蛋白
血管腔内圆形或团块状	红细胞、血红素
胞质或核周粗大颗粒，多通道	脂褐素
FFPE组织弥漫性黄绿色背景	醛固定及组织处理诱导荧光
组织外区域同样发亮	载玻片、封片剂等

 

三、通透：决定抗体能够结合的亚定位

 

抗体分子难以自由穿过完整细胞壁，组织或细胞样本需要进行通透处理，为抗体进入细胞建立通道。通透的强度要结合目的蛋白的亚定位决定。

 

如果是需要对跨膜蛋白的胞外结构域或需要维持天然膜构象的抗原进行染色，可以在固定后先尝试不通透看看效果。Triton X-100或甲醇处理可能破坏膜结构，导致原本清晰的膜信号减弱或消失。

 

胞质内的抗原可先用低强度的Triton X-100或Saponin处理。Saponin或Digitonin皂苷类物质通过与胆固醇相互作用形成孔道，比Triton X-100更温和，有利于保持部分膜结构和表面抗原。但是皂苷类物质形成的通透性具有可逆性，需要在后续抗体稀释液和洗液中加入适量的Saponin，以保证抗体持续进入细胞。

 

核内抗原需要抗体穿透细胞膜和核膜。检测转录因子、组蛋白修饰及其他核内靶蛋白时，需要使用Triton X-100等通透力较强的非离子型去污剂。

 

四、抗原修复：防止表位被遮蔽

 

甲醛固定会导致抗原表位被封闭。而抗原修复就是逆转甲醛固定过程中形成的蛋白质交联，使被遮蔽的抗原表位重新暴露，从而让抗体能够精准识别并结合目标抗原。

 

一般在脱蜡水化后进行热诱导抗原修复。不同pH条件对不同表位的修复效果可能不同，我们建议以相邻切片比较酸性和碱性修复体系，并固定加热设备、温度、时间和冷却过程。抗原修复的具体操作可以查看这篇文章：抗原修复总弱染？

 

五、按照样本和靶点建立匹配的解决方案

 

建议根据以下条件进行小规模的预实验。

 

样本或靶点	建议优先尝试	需留意的问题
培养细胞表面抗原	短时PFA固定，不通透，可先做活细胞表面染色	Triton或甲醇导致膜结构和表位受损
可溶性胞质蛋白	Saponin或低浓度Triton温和通透	固定前通透会造成蛋白流失
核内抗原	Triton通透	通透不足遮蔽表位
细胞骨架及细胞器蛋白	PFA-Triton与甲醇条件平行筛选	甲醇或强去污剂会改变细胞器结构
冰冻组织切片	轻度固定，按定位决定是否通透，可以先不做修复	过度固定和强通透导致信号流失
FFPE组织切片	标准化固定和脱蜡，以pH 6与pH 8～9热修复平行筛选	修复不足、过度加热、切片脱落和背景升高

 

六、眼前的黑不是我们要的黑

 

刚荧光显微镜下几乎看不到目的蛋白荧光，或视野中的细胞间存在散在的发光点，说明免疫荧光无信号，实验失败。我们可以从以下几个方面进行排查：

 

可能原因	解决方案
目的蛋白表达量低	· 查阅参考文献，核实待检细胞是否表达目的蛋白以及目的蛋白的表达丰度 · 通过WB验证蛋白是否在样品中表达及表达丰度 · 建议使用间接免疫荧光检测，以放大信号
目的蛋白在胞内	· 用甲醇和丙酮固定可透化细胞 · 甲醛固定，需尝试不同百分比的Triton X-100 (0.1-0.25%)或Tween-20进行通透 · 适当延长通透时间
抗体不适用ICC/IF	查看抗体说明书，是否经ICC/IF验证
一抗与二抗不匹配	· 确保使用针对一抗物种产生的二抗 · 确保二抗针对的同种型与一抗同种型相匹配
抗体浓度过低	· 增加一抗/二抗的工作浓度，或者通过梯度稀释确定抗体最佳稀释度 · 建议4℃过夜孵育
一抗不与靶标蛋白结合	· 使用经验证适用于检测靶标蛋白的一抗 · 设置阳性对照
荧光信号淬灭	· 避光条件下孵育荧光抗体 · 样品封片时加入抗淬灭试剂 · 建议封片后立即进行成像
荧光显微镜通道选择不合适	确保选择的荧光团激发/发射波长与检测通道相匹配