「ELISA问诊室」组织匀浆三剑客：手工研磨vs机器匀浆vs超声粉碎，谁是你的最优选？

ELISA（酶联免疫吸附测定）作为一种快速、灵敏、准确的免疫学常用检测方法，可检测样本种类多样，如血液、细胞培养上清及裂解液、组织匀浆等。样本的收集时间、处理方法和保存方案都会影响ELISA结果的准确性。

「ELISA问诊室」第5期将对常见组织样本的处理方法进行整理，供大家参考借鉴。

组织匀浆具体操作步骤

1.  用无菌洁净的工具解剖目标组织，并用预冷的PBS缓冲液（0.01M，pH=7.4）或生理盐水洗涤组织，以去除残留的血液和组织液。尽快将其置于冰上，防止被蛋白酶降解。如果暂时不处理组织，需浸入液氮中速冻，在-80℃保存样品。

2. 用滤纸拭干组织块以及剔除附属的结缔组织和脂肪组织，然后称重，再用眼科剪刀和镊子剪碎将其切成尽可能小的碎块，方便匀浆。加入适量预冷的PBS，一般按1:9的重量体积比添加，比如1g的组织样品需加入9mL PBS。具体提交可根据实验需要进行微调，并做好记录。建议在PBS中加入蛋白酶抑制剂（如1mM PMSF）。整个过程尽量在冰上操作。

3. 匀浆操作有多种，比如：

（1）手工研磨：采用传统手法精心研磨获得组织匀浆。可能各实验室都有自己的“手法”吧。一般将样本置于玻璃匀浆器或研钵中，在冰上充分研磨。如果有液氮，可将组织块在液氮中“速冻”，然后在研钵中捣碎，并加入少量的PBS，快速研磨。组织液倒入新的试管或离心管，分多次用PBS洗涤研钵，最终PBS和样品质量体积比为1:9。除了PBS还推荐用50mM Tris+ 0.9% NaCL + 0.1% SDS, pH 7.3或者中等强度RIRP细胞裂解液，不建议使用含NP-40、Triton X-100和高浓度DTT的组分，会抑制抗原抗体反应。得到的匀浆液可使用超声波进一步处理。

（2）机器匀浆：用组织捣碎机上下研磨组织匀浆（10000-15000 r/min），或用组织匀浆机进行（匀浆时间10s/次，间隙30s，连续3-5次）。操作过程在冰上进行，皮肤、肌肉组织等可以适当延长匀浆时间。

（3） 超声粉碎：提前将蛋白酶抑制剂（如PMSF）或磷酸酶抑制剂，按照1:100的体积比加入到RIRP裂解液中，快速摇匀后静置冰上。按照1:9的质量体积比，在剪碎的组织中加入对应体积的裂解液。将超声破碎仪功率调至25%，超声2s，间隔5s，总时间2-5min，视样品匀浆情况调整总时长。

（4）冻融裂解：可能有的实验室会采用反复冻融的方式使组织完全裂解，比如将组织放在-20℃或-80℃冻存，室温条件下融化。此方法操作时间超长，且容易造成蛋白质降解。

4. 将制备好的匀浆在4℃ 5000g离心5分钟，留取上清用于检测，或分装冻存于-20℃或-80℃。

5. 蛋白浓度经决定实验结果的成败，因此根据实验需要，可以先定量总蛋白，便于统计分析数据。一般总蛋白浓度需要1-3 mg/mL。

注意：